Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: redakce@gyne.cz

VAKCINACE PROTI LIDSKÝM PAPILOMAVIRŮM A JEJICH KONTROVERZE – část II. 

Vaccinations against human papillomaviruses and their controversions- part II

D. Driák1,  M. Dyrhonová2, R. Tachezy3

1Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a FN Na Bulovce, Praha 8,

přednosta prof. MUDr. Michael Halaška, DrSc.

 2Infekční oddělení NsP Mělník, primář MUDr. Jan Galský, Ph.D.

3,Oddělení experimentální virologie, Národní referenční laboratoř pro papilomaviry, ÚHKT Praha

Vakcíny proti HPV

Identifikace lidských papilomavirů coby primární příčiny cervikálního karcinomu byla podmínkou k výjimečné možnosti vývoje protinádorové vakcíny. V konečných důsledcích, zabránění rozvoje malignity, se HPV vakcína dá srovnat snad jen s vakcínou proti virové hepatitidě B (VHB). I virová hepatitida B se dává při jejím chronickém průběhu do souvislosti se vznikem karcinomu. Živé, atenuované či inaktivované vakcíny běžně užívané (např. proti poliomyelitidě, spalničkám), které jsou vysoce účinné, principielně nemohly být použity pro vývoj očkovací látky proti HPV z důvodu onkogenního potenciálu papilomavirů. Mimo to, obtíže s jejich vývojem souvisí s biologií viru. HPV se nemnoží na běžných tkáňových kulturách, takže příprava antigenů je založena na technologiích genového inženýrství. Příprava vakcíny proti všem 18 onkogenním typům by byla velmi složitá a je výhledem do budoucnosti. První vakcíny jsou logicky cíleny proti nejčastějšímu typu HPV 16, event. HPV 18.

Vědecký výzkum očkovacích látek proti HPV je současně zaměřen na 3 druhy vakcín:

1. Profylaktické vakcíny mají společný cíl, navodit tvorbu neutralizačních protilátek, které mají zabránit infekci HPV.

Prvním počinem v úspěšném vývoji profylaktické vakcíny byla práce Jiana Zhoua a kol. z roku 1991 [Sláma, 2007]. Vznikly nové tzv. VLPs vakcíny (VLPs, virus-like particles, viru podobné částice). Bylo objeveno, že je-li v rekombinantních systémech dostatečné množství molekul hlavního kapsidového proteinu L1, pak jejich samovolným shlukováním vznikají viru podobné partikule (self assembling property), které jsou od virionů v elektronovém mikroskopu morfologicky nerozeznatelné. Neobsahují však DNA, jsou tedy neinfekční, přičemž jsou vysoce imunogenní a téměř excelentně snášené. Papilomavirové VLPs mohou být produkovány celou škálou buněk. Ve výzkumech užívané a do klinické praxe zaváděné jsou očkovací látky připravované na geneticky zmanipulovaných kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae), dále pomocí rekombinantních baculovirů v kulturách buněk hmyzího původu. Neutralizační aktivita protilátek iniciovaných očkovací látkou proti HPV je téměř jedinečně genotypově specifická. Experimentálně byla potvrzena indukce vysoké koncentrace neutralizačních protilátek, blokáda virionů protilátkami in vitro, ověřena pasivní imunizace přenosem specifických IgG a ochrana pokusných zvířat po parenterální aplikaci VLPs [Tomson, 2004]. Je třeba zdůraznit, že v ochraně žen před papilomavirovou infekcí, jsou zásadní protilátky přítomné v mukóze genitálního traktu, zejména v cervikálním sekretu. 

Jako alternativu k VLPs tvořených L1 se některé výzkumy zaměřují na kapsidový protein L2. Jeho nevýhodou je slabší imunogennost  a nižší dosahované titry protilátek. Výhodou je naopak zkřížená neutralizační aktivita protilátek. Pokud by se podařilo překonat slabou imunogenicitu, je L2 velmi perspektivní jako profylaktická vakcinace proti širokému spektru HPV [Tomson, 2004, Prymula, předn. 2009]. Kromě L1 a L2 se ve výzkumu preventivních vakcín testují syntetické, rekombinantní peptidy, proteiny a DNA papilomavirů.

Úspěch pilotní studie s monovalentní vakcínou proti HPV 16 vedl k výrobě bivalentní a kvadrivalentní vakcíny. V současné době probíhají multicentrické, placebem kontrolované  studie tří vakcín: kvadrivalentní (6, 11, 16, 18) Silgard (Gardasil) v Evropě, USA a Jižní Americe, bivalentní (16, 18) Cervarix v Evropě, USA, Kanadě a Jižní Americe a monovalentní (16) vakcína pod dohledem National Cancer Institute (NCI) v Kostarice. U prvních dvou jsou již  k dispozici časově extendované (6,4 roku) výsledky a obě jsou v prodeji na českém trhu.

Kvadrivalentní vakcína Silgard® (Gardasil®) firmy Merck Sharp & Dohme proti dvěma nejběžnějším vysokorizikovým HPV 16 a 18 a dvěma nejčastějším nízkorizikovým HPV 6 a 11 vykazovala téměř 100% účinnost v protekci před perzistující infekcí a karcinomem děložního hrdla, CIN II/III, adenocarcinoma in situ (AIS), VIN II/III a VaIN II/III. Výskyt genitálních bradavic se snížil o 70 % [Freitag 2007]. Jde o aktivní imunizaci, kdy po aplikaci této očkovací látky dojde k tvorbě typově specifických ochranných protilátek.

Dne 8. června 2006 americký Úřad pro potraviny a léčiva (Food and Drug Administration, FDA) schválil kvadrivalentní vakcínu proti HPV typům 6, 11, 16 a 18 jako „vakcínu proti rakovině děložního čípku, cervikálním (CIN II/III, AIS), vulvárním (VIN II/III) a vaginálním (VaIN II/III) prekancerózám způsobeným typy 16, 18 a jako prevenci proti bradavicím genitálií a nízkému stupni cervikálních lézí (CIN I), způsobených typy 6, 11, 16 a 18,  pro dívky a ženy ve věku 9-26 let“. Dne 20. září 2006 evropská komise European Medical Evaluation Agency (EMEA) schválila Silgard jako první vakcínu v Evropské unii k použití u dívek ve věku 9-15 let a u žen ve věku 16-26 let ve stejných indikacích, jako FDA schválila Gardasil. Po rozhodnutí evropské komise proběhla i v České republice kategorizace Silgardu, který je od 5. prosince 2006 dostupný na našem  trhu.

Každá jednotlivá dávka Silgardu o velikosti 0,5 ml obsahuje 20 μg L1 HPV typu 6, 40 μg L1 HPV typu 11, 40 μg L1 HPV typu 16 a 20 μg L1 HPV typu 18. Kapsidový protein L1 ve formě VLPs se získává rekombinantní DNA technologií na Saccharomyces cerevisiae CANADE 3C-5 (kmen 1895). Jako adjuvans je přidaný amorfní hydroxyfosffát-sulfát hlinitý (AAHS) s obsahem 225 μg Al.

Silgard se aplikuje ve 3 dávkách intramuskulárně do deltového, případně horní části anterolaterální oblasti stehenního svalu v optimálním časovém schématu 0, 2 a 6 měsíců. Minimální odstup mezi první a druhou dávkou činí 1 měsíc a mezi druhou a třetí dávkou 3 měsíce. Celý cyklus tak lze absolvovat v minimu 4 měsíců. Odstup mezi první a druhou dávkou se nemá prodlužovat, třetí dávku je možné aplikovat až do roka od začátku očkování. Podle doporučení Federal Advisory Committee on Immunization Practises (ACIP) z roku 2006, je-li naopak 2. či 3. dávka vakcíny podána o 4 dny dříve než je stanovený minimální interval (1 měsíc u 2. dávky, 3 měsíce u 3. dávky), se pak doporučuje tuto dávku opakovat, ne však dříve než po uplynutí minimálního intervalu 4 týdnů, a to pro možnou interferenci vakcinačního antigenu s imunitní odpovědí na očkovací látku podanou v nesprávný termín. Až tato opakovaná, ve správném termínu podaná dávka se řadí do příslušného očkovacího schématu a případně po ní následující aplikace vakcíny se realizuje v termínu počítaném od této opakované vakcinace. Intramuskulární aplikace do gluteální oblasti není obecně doporučovaná především pro různou vrstvu tuku a menší lymfatickou drenáž v této oblasti. Do spádové uzliny může dojít nestandardní množství očkovací látky a antigenní podnět pro tvorbu protilátek tak nemusí být dostatečný.

Maximálního titru protilátek je dosaženo měsíc po třetí dávce, poté koncentrace mírně klesá, až se mezi 30-36 měsíci po zahájení očkování hladina protilátek stabilizuje.

Z nežádoucích účinků byly nejčastější nezávažné lokální reakce jako otok, bolest, svědění, erytém, krvácení v místě injekce, z celkových reakcí byla nejběžnější horečka. Vzácně, s frekvencí pod 1 % se objevila kopřivka, ještě vzácněji bronchospasmus, bolesti hlavy a kloubů. Anafylaktický šok byl zaznamenán u jednoho případu z 20 000 očkovaných. Kontraindikací podání vakcíny je přecitlivělost na kteroukoliv komponentu přípravku, alergická reakce na předchozí podanou dávku Silgardu. Za kontraindikaci platí těhotenství, i když nebyl pozorován vyšší výskyt vrozených anomálií oproti skupině s placebem ani teratogenní účinky v pokusech na zvířatech. Pokud se žena začne očkovat v době, kdy ještě o svém těhotenství neví, doporučuje se vakcinaci přerušit. Kontraindikací je středně závažné a závažné horečnaté onemocnění jakékoli etiologie. Naopak lehké nachlazení, lehká respirační infekce nebo teplota nízkého stupně není důvodem k odkladu očkování. Rovněž lze očkovat ženy kojící. Vakcína se nesmí aplikovat intravaskulárně a je nutná opatrnost v případě hemokoagulačních poruch a u imunosuprimovaných jedinců. Nejsou žádné zkušenosti s podáváním Silgardu subkutánně či intradermálně, proto jej výrobce nedoporučuje provádět.

Bivalentní vakcína Cervarix™ firmy GlaxoSmithKline proti dvěma nejčastějším onkogenním typům HPV 16 a 18 obsahuje po 20 μg L1 těchto dvou virů. Získává se rekombinantně pomocí expresního systému bakulovirů v kultuře buněk hmyzího původu (Hi-5 buňky). Pomocným prostředkem je unikátní adjuvantní systém II. generace, AS04, obsahující 3-O-deacyl-4´-monofosforyl-lipid A, což je detoxifikovaný lipopolysacharid Salmonelly minnesoty adsorbovaný na amorfní hydroxid hlinitý. Obsah hliníku činí 500 μg.

Adjuvantní prostředky I. generace založené na solích aluminia nejsou schopné vytvářet cytotoxickou T-lymfocytární buněčnou aktivitu. Lipopolysacharid je součástí membrány gram-negativních bakterií a jeho lipofilní část (lipid A) jako mohutný stimulátor prozánětlivých cytokinů může vést až k rozvoji septického šoku. Monofosforylací lipidu A (monofosforyl-lipid A, MPL-A) se podstatně sníží jeho toxicita, ale adjuvantní schopnosti zůstanou zachovány. Lipopolysacharid patří k tzv. nebezpečným vzorům (pathogen-associated molecular patterns), které jsou rozpoznávány specifickými receptory na povrchu buněk prezentujících antigen (antigen presenting cells, APC). Mezi receptory patří i tzv. toll-like receptory. Dendritické buňky, které jsou profesionálními APC, po aktivaci receptorů nebezpečnými vzory vyzrávají a aktivují lymfocytární T receptor. T lymfocyty se za účasti cytokinů diferencují v Th1 nebo Th2. Th1 aktivují makrofágy, přirozené zabíječe a další efektorové buňky realizující buněčnou imunitu. Th2 aktivují B lymfocyty k produkci protilátek. Významný pool B-paměťových lymfocytů zajišťuje rychlou produkci protilátek po vystavení stejnému antigenu. Právě s monofosforyl-lipidem A bylo v poslední době vytvořeno několik adjuvantních systémů a AS04 byl zařazen kromě Cervarixu do vakcín proti hepatitidě B (Fendrix), ve stadiu klinického zkoušení jsou zatím  vakcíny proti malárii a herpetickým infekcím [Beran, 2007].

Jednotlivá dávka 0,5 ml se aplikuje do stejného místa nitrosvalově do oblasti deltového svalu celkem třikrát, v časovém schématu 0, 1 a 6 měsíců. Klinické studie byly rovněž velmi úspěšné, vakcína měla 97% účinnost v protekci před novou infekcí HPV a 100% protekci před CIN II/III asociovanou s typy 16 a 18.  Navíc byla ve studiích zdokumentována částečná cross-protekce proti fylogeneticky příbuzným onkogenním typům.

V ČR prošel administrativním řízením, byl zaregistrován, resp. kategorizován a je od 20. října 2007 v prodeji. Jeho indikace je prevence CIN II/III a cervikálního karcinomu kauzálně spojených s HPV typu 16 a 18. Je určen pro ženy a dívky ve věku 10-25 let. Z nežádoucích účinků  je nejčastější bolest v místě vpichu, zarudnutí, otok, z celkových reakcí únava, cefalea, myalgie, dále horečka, artralgie, pruritus, kopřivka, nauzea, zvracení, průjem, bolesti břicha. Méně než u 1 % se objevila závrať a infekce horních cest dýchacích. Kontraindikací je přecitlivělost na kteroukoli z komponent přípravku a akutní vážné a středně závažné horečnaté onemocnění. Při lehké respirační infekci lze očkovat. Nejsou známky, že by Cervarix působil škodlivě na  graviditu, porod nebo vývoj plodu, zatím však nejsou dostatečné podklady pro doporučení vakcinace v těhotenství a proto je třeba jej odložit až po jeho ukončení. Během laktace lze očkovat, pokud výhody převáží nad možnými riziky. Cervarix nesmí být podán intravaskulárně nebo intradermálně, o subkutánním podání nejsou údaje. U osob s koagulopatií může po intramuskulární aplikaci dojít ke krvácení.

Kromě parenterální aplikace se testují alternativní, méně invazívní způsoby aplikace VLPs: nasální (sprej, aerosol) a perorální. Některé z nich dosahují obdobných protilátkových odpovědí jako parenterální vakcinace [Tomson, 2004]. Výrobní a distribuční náklady na vakcíny „první generace“ jsou příliš vysoké a jejich použití pro rozvojové země je nemyslitelné. Mnoho pozornosti se v současné době věnuje vývoji rostlinných vakcín proti lidským papilomavirům. Levná vakcína připravená na rostlinách by mohla vyřešit problém nemoci i v rozvojových zemích. Za zmínku stojí, že jen v průběhu roku 2003 se podařilo nejméně pěti výzkumným skupinám exprimovat na rostlinách proteiny viru HPV 16. Podařilo se dokonce na rostlinách Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, na bramborách a rajčatech připravit i pseudovirové částice HPV a prokázat jejich imunogennost na experimentálních zvířatech po perorálním podání. Dalšími manipulacemi se produkce proteinu HPV zvýšila tak, že reprezentoval 0,5 % všech rozpustných bílkovin. Jiná skupina uspěla v přípravě proteinu E7 HPV 16. Jeho parenterálním podáním se podařilo vyvolat imunitu k podnětu k transformaci v nádorové buňky.

2. Terapeutické vakcíny. Jelikož od HPV nákazy k rozvoji cervikálního karcinomu uplyne obvykle mnoho let, je cílem vyrobit vakcíny eliminující aktuálně perzistující virovou infekci, vakcíny indukující regresi prekanceróz. Po integraci virové DNA a ztrátě části genů infikované buňky neexprimují L1 a L2 a je nutné se zaměřit na geny a proteiny, které v buňce z virového genomu zůstaly. Virové E6 a E7 onkoproteiny jsou selektivně exprimovány v průběhu rozvoje a progrese malignity, jsou tumorspecifickými antigeny a představují přirozené cíle pro specifickou protinádorovou imunoterapii. Zásadní úlohu zřejmě hraje buněčná imunita. HPV-asociované infekce a malignity se vyskytují častěji u osob s narušenou buněčnou imunitou (např. AIDS, transplantace), genitální bradavice u osob léčených imunosupresivy regredují často po vysazení léčby, spontánní infiltrace CD4+ a CD8+ T lymfocyty v regredujících bradavicích je častější než v bradavicích bez regrese [Tomson, 2004].  Nejčastěji se vědci zaměřují na využití cytotoxických T lymfocytů, které likvidují buňky s exprimovanými antigeny E6 a E7. 

Podkladem testovaných terapeutických vakcinačních strategií jsou živé vektory virové (vakcinie, adenovirus, adeno-asociovaný virus, alfavirus RNA částice, HPV-pseudoviriony) nebo bakteriální (Listeria monocytogenes, Salmonella, bacil Calmette-Guérinův, Lactococcus lactis), peptidy, lipopeptidy, proteiny, nukleové kyseliny (DNA, RNA), buňky (dendritické, nádorové), event. kombinace. Při kombinovaném přístupu se k prvnímu setkání s imunitním systémem používá jedna vakcína (DNA) a k posílení imunitní odpovědi následně virový vektor [Tomson, 2004]. Podmínkou je zachovat imunogenicitu, ale odstranit transformující vlastnosti onkoproteinů.

Po vakcinaci modifikovanými E6 a E7 HPV 16 a 18 připravovanými rekombinantně pomocí virů vakcinie došlo k významné regresi u 5 ze 12 pacientek s VIN II/III nebo VaIN II/III [Baldwin, 2003], resp. u 8 z 18 pacientek s VIN II/III [Davidson, 2003]. Protein E7 HPV 16 fúzovaný s  povrchovým antigenem viru hepatitidy B (HBsAg/E7) získaný rekombinantně pomocí lidských adenovirů se formuje do VLPs a jím provedená imunizace vyvolala významnou humorální i buněčnou imunitní odpověď in vivo [Baez 2005]. Peptidová vakcína z E7 HPV 16 indukovala u části žen regresi CIN II/III nebo VIN II/III [Muderspach, 2000]. Vakcína obsahující protein D z Haemophilus influenzae fúzovaný s E7 HPV 16 (PD-E7) vyvolala kompletní specifickou systémovou imunitní odpověď u 5 ze 7 pacientek s prekancerózami čípku [Hallez 2004]. Vakcína obsahující protein teplotního šoku (heat shock protein) z Mycobacterium bovis spojený s E7 HPV 16 (hsp65E7) chránila myši před nádorovými buňkami exprimujícími E7 [Chu, 2000]. Celulární vakcíny představují dendritické buňky s E7, které u pacientek indukují specifickou CD4+ a CD8+ T lymfocytární odpověď a lýzu infikovaných rakovinných buněk [Santin 1999]. Další perspektivní protinádorové vakcíny jsou založeny na samotných nádorových buňkách geneticky pozměněných tak, aby produkovaly cytokiny, které jsou schopné podstatně zvýšit imunitní odpověď k nádorovým antigenům .

K přípravě terapeutických vakcín se využívají i proteiny oblastí E1, E2, E5 nebo jejich části, peptidy či kratší aminokyselinové sekvence. Získávají se opět rekombinantně pomocí  živých vektorů. Terapeutická vakcína obsahující E2 vyrobená rekombinantně pomocí viru vakcinie injikovaná přímo do dělohy vyvolala u většiny žen kompletní regresi CIN I-III.

3. Kombinované vakcíny jsou určené pro infikované ženy dosud bez patologického nálezu. Jejich cílem je stimulovat protilátkovou odpověď proti L1, event. L2, a současně indukovat tvorbu cytotoxických T lymfocytů proti časným proteinům, zejména E6 a E7.  K výrobě kombinované vakcíny se perspektivně jeví fúzní (chimérické) VLPs, obsahující kapsidový protein L1, event. L2, s inkorporovanou částí nestrukturálního proteinu E7, event. E6 nebo E2 [Wakabayashi, 2000]. První chimérické VLPs obsahující L1 s E7 HPV 16 v klinickém pokusu na lidech byly použity v roce 2007. U 39 % pacientek s CIN II/III došlo během 24 měsíců ke zlepšení nebo normalizaci nálezu [Kaufmann, 2007].

Terapeutické a kombinované vakcíny jsou prozatím ve stadiu klinických experimentů.

Tabulka 1

Základní charakteristiky obou registrovaných vakcín

Seznam literatury bude uveden ve třetí, závěrečné části článku v šestém čísle Gynekologa.