Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: redakce@gyne.cz

APOPTÓZA V GYNEKOLOGII A PORODNICTVÍ.

(Část I, patofyziologie apoptózy)

Apoptosis in Gynaecology and Obstetrics,

(Part I, patophysiology of apoptosis)

Souhrn

Apoptóza je fyziologická forma buněčné smrti, jejíž dysregulace může vést k řadě maligních, autoimunitních či degenerativních onemocnění. Buňky podléhající apoptóze vykazují charakteristické změny - jaderné, cytoplazmatické, mitochondriální aj. Tento článek uvádí současné poznatky o apoptóze se zaměřením na gynekologii a porodnictví. Pochopení mechanismů apoptózy může hrát důležitou roli v diagnostice a léčbě nádorových onemocnění.

Summary

Apoptosis is a physiological form of cell death, whose dysregulation may lead to many malignant, autoimmune or degenerative diseases. Apoptotic cells are characterised by specific changes - nuclear, plasma membrane, mitochondrial etc. This article presents contemporary knowledge about apoptosis in gynaecology and obstetrics. Understanding the mechanisms of apoptosis might be an important part of the diagnostics and therapy in oncology.

1. Úvod

Apoptóza neboli programovaná buněčná smrt je slovo často užívané a citované. Díky intenzivnímu výzkumu v posledních dvaceti letech známe již mnohé o jejích mechanismech.  Stane-li se však ovlivnění programované buněčné smrti běžným terapeutickým postupem, je zatím stále nejasné.

2. Historie

Slovo „apoptosis“ pochází z řeckého písemnictví. Tento termín navrhl profesor James Cormack z katedry řečtiny na aberdeenské univerzitě. Z řeckého pojmu určeného pro opadávaní okvětních plátků květů či listů ze stromů mu znovu vrátil jeho medicínské užití, i když v poněkud jiném významu, než mu dali Řekové před dvěma tisíciletími – Hippokrates používal termín apoptosis pro „opadávání masa z kostí“. Později jej Galén rozšířil i na opadávaní strupů a strupovitých útvarů obecně, což Cormack bezpochyby věděl. K použití termínu apoptosis jej možná vedl Kerrem a kolegy popisovaný vznik „puchýřků“ na povrchu apoptické buňky. Kerr, Curie a Wyllie v 70.letech 20.století původně použili termím „programmed cell necrosis“ a to v souvislosti s označením jiné formy buněčné smrti, nežli je nekróza. Záhy však ve svých publikacích užívají nového pojmenování, tedy apoptosis. Kerr a kol. ve své publikaci popsali apoptózu jako: „… mechanismus kontrolované buněčné smrti, který hraje komplementární, avšak opačnou roli ve vztahu k mitóze v regulaci buněčných populací živočichů“  [21].

Fenomén programované buněčné smrti byl ale znám již mnohem dříve. Roku 1842 popsal poprvé německý biolog C. Ch.Vogt apoptózu během vývoje pulců ropušky starostlivé (Alytes obstetricians). Vogt popsal předurčenou smrt buněk na modelovém příkladu přeměny pulce v žábu, kdy buňky ocasu v procesu ontogeneze odumřou, takže u žab, které ho nepotřebují, již neexistuje [2]. Přibližně v 80. letech 19. století popsali Veigert a Conheim zvláštní variantu nekrózy s velmi pomalým rozpadem buněk. Je velmi pravděpodobné, že již v těchto případech šlo také o jedna z prvních pozorování apoptózy [38, 44]. Rozsáhle se studiu apoptózy věnovala a věnuje zejména embryologie (např. Glucksman 1951) [15].

V roce 1965 Kerr demonstroval, že podvaz portální žíly u krys vede k involuci buněk periportálního parenchymu, po kterých zbylo množství malých kulatých vezikul, ale bez dalších znaků zánětlivé reakce, která je obvyklá při nekróze. Podrobným studiem tohoto jevu prokázal, že tyto vezikuly obsahují intaktní organely, chromatin a jaderné zbytky. Pro popis tohoto jevu nejprve užil název „shrinkage necrosis“, který o několik let později nahradil pojmem „apoptosis“ [25, 26, 33].

V roce 1987 vyslovil Wyllie dva základní axiomy ve vztahu k apoptóze po účinku toxických látek:

1) Apoptóza je indukována škodlivými stimuly menší síly, než jaké vedou u stejných buněk k nekróze.

2) Apoptózu je snadnější vyvolat v těch buněčných populacích, které za fyziologických podmínek prodělávají rychlou obměnu buněčné populace [46].

V 80. letech 20. století došlo k intenzivnímu vědeckému bádání a četné morfologické, biochemické a cytogenetické práce položily základy vědění o apoptóze. Zásadní zvrat v rozlišování apoptózy od nekrózy přinesla cytogenetická a biochemická pozorování. Bylo zjištěno, že apoptóza je děj spojený se štěpením DNA na mnohočetné fragmenty [26]. V roce 1984 vědci objasnili spojitost mezi štěpením DNA při apoptóze a indukcí endonukleázy

a prokázali, že její aktivita je závislá na přítomnosti kalciových iontů. V roce 1991 pak Gaido a Cidlowsky izolovali jednu z těchto endonukleáz  [26, 44].

Sydney Brenner, H. Robert Horvitz a John E. Sulston v roce 2002 obdrželi Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství za výzkum v oblasti genetické regulace vývoje orgánů a programované buněčné smrti [16].

3. Definice

Apoptóza, „programovaná buněčná smrt“ neboli „buněčná sebevražda“ je fyziologický, geneticky řízený proces autodestrukce buňky, aktivovaný zanikající buňkou v situaci, kdy buňka se stala pro tkáň nebo organismus nepotřebnou, nežádoucí nebo škodlivou. Apoptóza se vyskytuje u všech mnohobuněčných a u některých jednobuněčných organismů a má základní význam v obraně proti virům a bakteriím, v morfogenezi, homeostáze, ontogenezi a funkci imunitního systému a v odpovědi na různá poškození, zvláště při degenerativních a nádorových chorobách [16, 21, 25].

4. Patofyziologie

4.1.  Nekróza

Nekróza buňky je považována za děj patologický. Je vyvolána různými vlivy na buňku, ať již fyzikálními jako jsou výkyvy teploty, záření, mechanické poškození atd., nebo  chemickými, např. toxiny, jedy, enzymatickými pochody. Nekrózu buňky je taktéž možné vyvolat hypoxií. Síla působící noxy bývá většinou velmi výrazná. Nekrózu také může vyvolat virová infekce buňky, různé bakteriální toxiny nebo náhlé vyčerpání buněčných energetických zásob.

Zánik buňky nekrózou je výsledkem její neschopnosti udržet své strukturálně-funkční vymezení od mezibuněčného prostoru vůči okolním buňkám, tedy buněčnou homeostázu [32]. Jinými slovy, k nekróze vede rozsáhlé selhání normálních fyziologických drah zodpovědných za udržení buněčné homeostázy, tedy zejména fatální poruchy v transportu iontů, produkci energie a udržení pH balance.

Při nekróze dochází k desintegraci cytoplazmatické membrány, což vede k narušení rovnováhy vnitřního prostředí buňky. To vede k edému jak celé buňky, tak některých organel (mitochondrií, endoplazmatického retikula). Dochází ke kondenzaci chromatinu a zmenšení buněčného jádra (pyknóze), k agregaci chromatinu při periferii jádra (nástěnné hyperchromatóze). Poté nastává fragmentace jaderného chromatinu (karyorrhexe) a následně se rozpadá buněčné jádro na fragmenty (karyolýza). Poklesem buněčné proteosyntézy, způsobené poruchou integrity endoplasmatického retikula, Golgiho aparátu a mitochondrií, dochází v cytoplasmě k eosinofilii, resp. ke ztrátě přirozené basofilie.

Celý proces nakonec vede k enzymatickému poškození buňky a jejímu rozpadu. Obsah buňky se tak uvolní do okolí, přičemž enzymy takto uvolněné mohou poškozovat mezibuněčnou hmotu, tím indukovat nekrózu okolních buněk a způsobit tak řetězovou reakci. To vyvolá místní zánětlivou reakci mediovanou širokou škálou cytokinů. Mezi  prozánětlivé cytokiny řadíme interleukin IL-1β a tumor nekrotizující faktor TNF-α. Jejich hlavními producenty jsou aktivované mononukleáry. Destičkový růstový faktor (PDGF), leukocytární interferon IFN-γ a interleukin IL-6 jsou další důležité prozánětlivé cytokiny. Výrazně protizánětlivé cytokiny jsou transformující růstový faktor TGF-β a interleukiny IL-10, IL- 4 a IL-13  [32].

Ukázalo se, že stejný podnět může v buňce indukovat jak nekrózu tak apoptózu. Záleží na intenzitě, délce působení a rychlosti patogenního podnětu. Velmi intenzivní, náhlý podnět způsobí nekrózu buňky, zatímco stejný podnět menší intenzity či chronického charakteru, může iniciovat apoptózu [14, 16].

Recentní cytologická data naznačují, že nekrotická smrt buňky není pouze důsledkem patologických dějů, ale že může být rovněž součástí některých fyziologických procesů. Například během fyziologické obnovy sliznice tenkého střeva přispívá nekróza enterocytů ke odstraňování buněk stejně jako apoptóza a nevyvolává přitom lokální zánětlivou odpověď [36]. Genetické analýzy také naznačují, že nekrotická smrt buňky může za určitých okolností zastoupit během normálního vývoje smrt apoptotickou. Nekróza může také představovat významnou alternativní cestu likvidace nádorových buněk, které jsou díky mutacím schopny inaktivovat apoptotické signální dráhy. Zánětlivá reakce vyvolaná nekrózou může navíc potenciálně stimulovat imunitní odpověď organismu a dále zvyšovat počet usmrcených nádorových buněk [45].

Obr. 1.  Schéma nekrotické a apoptotické smrti buňky

/ Cancer 1994; 73: 2013-26/

4. 2. Apoptóza

Apoptóza je děj fyziologický i patologický. Za fyziologických podmínek zajišťuje tkáňovou homeostázu. Mechanismem apoptózy jsou eliminovány buňky, které jsou nadpočetné nebo pro organismus škodlivé. V období embryonálního vývoje jsou nadpočetné buňky odstraňovány při tvorbě prstů či tělních dutin plodu. Například v průběhu organogeneze se apoptóza podílí i na vývoji zevních pohlavních orgánů. Mezi 6.-7. týdnem vývoje plodu dochází k rozdělení kloaky na membránu urogenitalis a analis, membrana urogenitalis se v důsledku apoptózy buněk protrhne a vzniká tak orificium urogenitale primum, jež dává základ pro vytvoření ústí močové trubice. V postnatálním a dospělém období zodpovídá apoptóza za přestavbu fetální cirkulace, fyziologickou buněčnou a tkáňovou obnovu jak ji známe u povrchových epitelií, např. enterocytů. Uvádí se, že u průměrného dospělého lidského jedince zanikne denně apoptózou 50 až 70 biliónů buněk [54]. Apoptóza se učastní také cyklických změn během reprodukčního období ženy, jako je zánik buněk endometria v průběhu menstruačního cyklu, atrofie mléčné žlázy po menopauze. Apoptóza se také podílí na atrofizaci prostaty při snížení hormonální stimulace nebo na eliminaci nadbytečných aktivovaných T- a B- lymfocytů [16, 21, 33].

Apoptózu však může indukovat řada procesů: protilátky, kyslíkové radikály, ionizující záření, hypoxie, hypoglykémie, cytotoxické lymfocyty, deprivace růstových faktorů, hormonální dysregulace aj. V takovém případě je programovaná smrt buňky dějem patologickým, na rozdíl od nekrózy si však zachovává svůj geneticky řízený, programovaný charakter a zůstává aktivním procesem vyžadujícím energii [16, 25, 33].

Apoptóza může být indukována též ztrátou ukotvení buněk k extracelulární matrix. Pro tento pochod se používá termín „anoikis“ odvozený z řeckého výrazu pro „bezdomovectví“. Anoikis má význam zejména pro apoptózu epitelových buněk [22, 29]. Zajímavá je role anoikis v metastázování tumorů. Běžné buňky po ztrátě kontaktu s extracelulární matrix a sousedními buňkami stejné tkáně nejsou schopny růstu a/nebo přežití. Metastázující buňky tumoru mohou být proti aniokis chráněny a po odloučení od „mateřského“ nádoru se bez ztráty vitality šířit do dalších orgánů. Jejich ochranu proti aniokis pravděpodobně zprostředkovává TrkB protein a jeho ligand BDNF (brain-derived neurotrophic factor) [29, 53].

4.2.1. Poruchy apoptózy

Za patologických okolností mohou být poruchy programované buněčné smrti příčinou vzniku mnohých onemocnění. Apoptózu lze rozdělit na excesivní, předčasnou nebo oddálenou, tedy inhibovanou. Příkladem excesivní apoptózy je aplastická anémie s těžkou aplázií kostní dřeně a útlumem krvetvorby. Příkladem předčasné apoptózy mohou být neurodegenerativní onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, amyotrofická laterální skleróza, dále inzulin-dependentní diabetes mellitus, ateroskleróza či myelodysplastický syndrom. Apoptóza oddálená či inhibovaná je charakteristická především pro maligní onemocnění. Bývá pro ni typická přílišná exprese anti-apoptotických faktorů nebo mutace v genech proteinů zprostředkovávajících vnitřní část apoptické kaskády. Mezi nejznámější patří například mutace proteinu p53, transkripčního faktoru bránícího nádorovému bujení. Poruchy jeho funkce vedou k výrazné facilitaci tumorigeneze a snížení citlivosti nádorů na ozařování [31]. Tumorigenezi naopak přímo stimuluje mj. transkripční faktor NF-kB. Zvýšený počet genů kódujících NF-kB bývá spojen např. s akutní a chronickou myeloidní leukémií nebo rakovinou prostaty či prsu [31].

Defektní apoptóza se také vyskytuje u autoimunitních onemocnění jako jsou glomerulonefritidy, systémový lupus erytematodes a dále u virových onemocnění způsobených herpesviry, poxviry a adenoviry [44]. V případě autoimunitních chorob se zdá, že většina autoantigenů je během buněčné smrti různými způsoby modifikována. Tato pozorování vedou některé autory k hypotéze, že primární imunitní odpověď během vzniku autoimunitní reakce je zacílena na komponenty umírající buňky [13].

4.2.2. Znaky apoptózy

Tab. 1. Základní rozdíly mezi apoptózou a nekrózou

4.2.3. Signální dráhy apoptózy

Celý proces apoptózy je velmi složitě a více stupňově geneticky kódován. Účastní se ho velký počet genů a jimi regulovaných proteinových cytoplazmatických a membránových makromolekul. Apoptóza se zahajuje vždy tzv. signální fází, která představuje ještě reverzibilní okamžik apoptotické kaskády a během níž je ještě možné buněčné smrti zabránit.

Proces programované smrti může být spuštěn dvěma způsoby:

1. Vnější cestou, tj. stimulací specifických receptorů smrti (DR-Death Receptor) na povrchu buňky a uvolněním či aktivací některých specifických proteinů (bax, bim, bid, bad, DISC- buněčnou smrt navozující signalizující komplex, Death Inducing Signalling Complex).

2. Vnitřní cestou, v níž centrální roli hrají protein p53 a mitochondrie [8, 16].

Vnější signální cesta je někdy nazývána též cestou přes receptor smrti (Death Receptor). Receptory smrti a jejich ligandy mají zásadní úlohu v iniciaci apoptózy. Tyto receptory patří do rodiny receptorů pro TNF (tumor nekrotizující faktor). Mezi hlavní zástupce „receptorů smrti“ patří TNF receptory, Fas receptory či TRAIL receptory. Mají funkci senzorů, které po obdržení extracelulárního signálu (prostřednictvím navázání svých ligandů) vedou k rychlé iniciaci apoptózy v buňce. Signální dráhy jednotlivých receptorů se v určitých aspektech liší, stejně jako míra jejich zastoupení ve fyziologické regulaci apoptózy, nicméně jednotící prvky lze vysledovat u všech tří receptorových typů. Obsazení receptoru smrti jeho ligandem vede k oligomerizaci receptorů v membráně a aktivaci jejich specifických cytoplasmatických domén. Ty reagují s adaptorovými proteiny obsahujícími tzv. doménu smrti (DD - Death domain), jako jsou FADD, TRADD či Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1. Spojení několika receptorů s adaptorovými proteiny indukuje agregaci proteinů prokaspáz (zejména prokaspáz-8) a vznik komplexu DISC. Tento komplex byl prvně popsán v apoptotické signální dráze Fas receptorů. Dimerizace prokaspáz v komplexu DISC vede k jejich autoaktivaci. Aktivované kaspázy se uvolňují z komplexu DISC do cytoplasmy ve formě heterotetrameru. Působením aktivovaných kaspáz následně dochází k aktivaci vlastních efektorových kaspáz apoptózy a spuštění kaspázové kaskády [2, 16, 17, 21, 36]. Cílem vnější cesty je aktivace prokaspázy- 8 a prokaspázy-10 (viz obr.2).

V buňce se rovněž vyskytují bílkoviny tzv. klamající receptory, neboli návnady (Decoy receptors), které jsou analogy  receptorů smrti, ale navázání ligandu nevede k přenosu signálu do nitra buňky.  Zatím byly popsány decoy receptor DcR3 pro Fas ligand a tři decoy receptory pro TRAIL, receptory DcR1, DcR2 a OPG. Tyto receptory nemají funkční tzv. doménu smrti [17, 26].

Obr. 2.  Zjednodušené schéma vnější signální dráhy jdoucí přes Fas/TRAIL receptory smrti. Čáry zakončené plnou šipkou představují pozitivní interakce jednotlivých členů apoptotické kaskády, čáry zakončené kolmicí interakce negativní. Bližší podrobnosti viz text. Podle Jin a El-Deiry, 2005.

Vnitřní signální cesta je v zásadě aktivována dvěma způsoby: permeabilizací vnější mitochondriální membrány navozenou různými událostmi nebo přímým poškozením jaderné DNA vlivem různých metabolitů, toxinů, volných radikálů a jiných mutagenních sloučenin.   V případě poškození DNA a spuštění apoptózy hraje klíčovou roli gen p53 a jím kódovaný stejnojmenný protein, v případě mitochondriální vnitřní signální dráhy je dominantní událostí uvolnění cytochromu c do cytoplasmy a spuštění řady následných kroků.

Tumor supresorový protein p53 (označovaný jako „molekula roku 1993“ zvolená časopisem Science nebo též „strážce genomu“) je transkripční faktor, který působí třemi hlavními antikancerogenními mechanismy: (i) může aktivovat proteiny opravující DNA, je-li tato poškozena; (ii) je schopen zadržet buňku v určité fázi růstového cyklu a tím prodloužit období, během kterého může být DNA opravena nebo je (iii) schopen aktivovat apoptózu či zrychlenou buněčnou senescenci a tím iniciovat odklizení nereparabilní buňky. p53 je aktivován poškozením DNA a slouží jako posel k iniciaci apoptózy. U některých jednobuněčných organismů, např. u kvasinek, tento protein neexistuje [25]. Hlavní funkcí p53 je rozpoznat genetické poškození, iniciovat a katalyzovat jeho opravu. Léze DNA (především dvojité zlomy) vedou ke vzniku řady proteinů aktivujících p53. Výsledkem aktivace této dráhy je inhibice buněčného cyklu v G1/S fázi do doby, než je poškození opraveno [46]. Pokud protein p53 odhalí změnu DNA přesahující možnost reparace, zvýší se jeho exprese a indukuje syntézu dalších proteinů, které poškozují mitochondrie. Indukuje tvorbu proteinů Puma a Noxa, které zprostředkovávají odpověď buňky na genotoxické poškození. Protein p53 transkripčně dále reguluje např. geny pro Bax, Apaf-1, Fas, killer/DR5 receptory nebo protein pidd.

 Stejně jako vnější, i vnitřní signalizační apoptické dráhy jsou primárně iniciovány vně buněk. Centrálním regulačním místem vnitřní signalizační apoptické dráhy se ovšem zdají být  mitochondrie. Z hlediska apoptózy je pak klíčovou událostí permeabilizace vnitřní mitchondriální membrány navozená a kontrolovaná zejména proteiny tzv. Bcl-2 rodiny (viz níže) [17, 22].

Pokud převáží exprese tzv. BH123 proteinů z Bcl-2 rodiny, jako jsou proteiny Bak či Bax, dochází k ireverzibilnímu spuštění apoptózy. Již předtím aktivované pro-apoptotické tzv. BH3-only proteiny následně navodí oligomerizaci BH123 proteiů (Bak, Bax) a jejich inserci do vnitřní mitochondriální membrány. Bax/Bak poté vnější mitochondriální membránu permeabilizují, což v důsledku vede k vylití dalších apoptogenních proteinů, otevření velkých iontových kanálů ve vnitřní mitochondriální membráně (PTP, permeability transition pore complex)  i membráně vnější, dochází ke vtoku vody a ztrátě iontové nerovnováhy na mitochondriální membráně. Mitochondrie bobtná, ztrácí svůj membránový potenciál (DYm), vnější mitochondriální membrána praská a dochází k uvolnění matrix do cytoplasmy buňky. Celý tento proces vede k  smrti buňky jednak díky uvolnění mitochondriálních proteinů do cytoplasmy, což spouští další děje, a jednak díky ztrátě základní úlohy mitochondrie, tedy produkce ATP v dýchacím řetězci.

Mezi proteiny uvolněnými do cytoplasmy je i cytochrom c. Cytochrom c se váže na protein Apaf- 1 a za přítomnosti ATP/dATP vzniká komplex známý jako apoptozóm. Apaf-1 je adaptorová molekula vážící prokaspázu-9. Oligomerizací aktivovaná prokaspáza-9 posléze už jako kaspáza-9 aktivuje další, v rámci apoptotické kaskády konečné výkonné kaspázy (kaspázu-3, -6 a -7) [17].

Druhou důležitou skupinou proteinů uvolněných do cytoplasmy z mitochondriální matrix jsou tzv. IAP antagonisté. IAP proteiny jsou inhibitory apoptózy. Jde o anti-apoptotické proteiny zastavující apoptózu inhibicí aktivovaných kaspáz. IAP antagonisté jsou  uvolňovány z prasklých mitochondrií, váží se na IAP proteiny, obsazují tak vazebná místa pro kaspázy a tím IAP proteiny inaktivují, neboť k vazbě aktivovaných kaspáz už nemůže dojít. Mezi hlavní IAP antagonisty stimulující apoptózu patří proteiny Smac (second mitochondria-derived activator of caspses)/DIABLO, HtrA2/Omi a GSPT1/eRF3 (viz obr. 2).

Současně se zvyšuje tvorba volných kyslíkových radikálů, které zbylé mitochondrie dále poškozují [16, 21].

Obr. 3.  Zjednodušené schéma vnitřní signální dráhy zprostředkované mitochondriemi. Čáry zakončené plnou šipkou představují pozitivní interakce jednotlivých členů apoptotické kaskády, čáry zakončené kolmicí interakce negativní. Bližší podrobnosti viz text. Podle Jin a El-Deiry, 2005.

Signální fáze apoptózy je ukončena aktivací proteinů nazývaných kaspázy (caspases – cystein-requiring aspartate proteases) zodpovědných za proteolytickou degradaci intracelulárních proteinů. Jde o skupinu cysteinových proteáz hydrolyzujících proteiny speciálně v místě aspartátu. Kaspázy mají klíčový význam v celém procesu programované buněčné smrti a jejich aktivace zahajuje ireversibilní, neboli rozkladovou fázi apoptózy („point of no return“).

V současnosti je známo 14 lidských isoforem těchto enzymů, které lze podle jejich funkce zhruba rozdělit do tří hlavních skupin [17].

1.     Kaspázy učastnící se zánětlivé reakce, nikoliv apoptózy. Tato skupina zahrnuje kaspázy -1, -4, -5, -11, -12, -13 a -14.

2.     Iniciační kaspázy apoptické kaskády. Tato skupina zahrnuje kaspázy obsahující buď efektorovou doménu smrti DED (kaspázy- 8 a -10) nebo tzv. doménu CARD, která slouží ke zprostředkování interakce kaspáz s různými adaptorovými molekulami (kaspázy- 2 a -9).

3.     Efektorové (výkonné) kaspázy apoptotické kaskády (kaspázy-3, -6 a -7) jsou typicky aktivovány iniciačními kaspázami a během postupující apoptózy špěpí různé buněčné substráty.

Kaspázy jsou syntetizovány ve formě  neaktivních molekul, tzv. prokaspáz, které se pro výkon své funkce musí aktivovat výše uvedeným signálním procesem. Obě signální dráhy směřují aktivací svých prokaspáz (kaspázy- 8 a -10 vnější signální cestou a kaspázy-9 vnitřní signální cestou) ke spuštění proteolytické aktivity výsledných efektorů, jimiž jsou kaspáza-3, -6 a -7. Aktivace kaspázy -3 má pro buňku smrtící důsledky. Kaspázy inhibují reparační mechanismy DNA, působí proteolýzu bílkovin skeletu buňky, proteinů membrán, destruují cytoskeletální struktury a vedou k aktivaci endonukleáz (CAD - caspase activated DNAse). Účinkem endonukleáz dochází k fragmentaci jaderné DNA. Jde o ireverzibilní událost, která odsoudí buňku ke smrti. Bylo dokázáno, že tato fragmentace je následkem  aktivace endogenní Ca2+a Mg2+ dependentní jaderné endonukleázy. Tento enzym selektivně štěpí DNA, vnikají tak mono- a oligonukleozómové fragmenty DNA [16, 21, 32]. Důležitým cílem kaspáz je jedna z podjednotek DNA fragmentačního faktoru (DNA fragmentation factor 45 kDa subunit, DFF45/ICAD), která hraje zásadní roli v intranukleosomální degradaci DNA během apoptózy. Významnou skupinou proteinů napadaných kaspázami jsou proteiny podílející se na opravách poškozené DNA, jako je např. poly(ADP-ribose)polymerasa (PARP). Kaspázy štěpí také některé proteiny respiračního řetězce, což vede k charakteristickým mitochondriálním změnám spojeným s apoptózou (ztráta transmembránového potenciálu aj.). Kaspázy atakují i proteiny regulující buněčný cyklus, např. inhibiční faktory jako Cdc27, Wee1 nebo některé Cdk inhibitory. Mezi strukturální proteiny štěpené kaspázami patří např. fodrin či gesolin, jejichž proteolýza vede k rozpadu sítě aktinových filament. Mezi další kaspázami atakované proteiny buněčného skeletu patří např. keratiny 18 a 19 či vimentin. Štěpení jaderných laminů vede ke smršťování jádra. Rozklad proteinů zodpovědných za vzájemnou adhezi buněk v tkáni, jako jsou b- nebo g-catenin, vede ke ztrátě buněčných interakcí, což dále oslabuje schopnost buněk přežívat. Kaspázy rovněž štěpením likvidují i některé anti-apoptotické proteiny jako Bcl-2, Bcl-Xl, IAPs nebo FLIPL. Jiné pro-apoptotické naopak štěpením aktivují a apoptotický signál tak zesilují (např. protein Bid) [17].

Tab. 2. Vybrané proapoptotické a antiapoptotické molekuly. Podle Jin a El-Deiry, 2005 a Holcik a kol., 2005.

4.2.4. Vzájemné propojení vnější a vnitřní signální dráhy

Spuštění apoptózy vyžaduje v některých buňkách aktivaci obou signální drah, vnější i vnitřní, zároveň. S přihlédnutím k nutnosti spuštění jen jedné či obou signálních cest můžeme buňky rozdělit do dvou tříd: na buňky I. typu, kterým k plnému spuštění apoptózy stačí aktivace kaspázy-8 v komplexu DISC, a na buňky II. typu, jež ke spuštění apoptózy potřebují i signály z vnitřní mitochondriální dráhy, neboť jejich DISC komplexy obsahují ke spuštění apoptózy nedostatečné množství FADD a kaspázy-8 [39]. Množství kaspázy-8 je nicméně dostatečné na to, aby dokázala štěpit jeden z proapoptotických proteinů z rodiny bcl- 2, a to cytosolický protein Bid. Kaspázou-8 rozštěpený Bid putuje jako tBid k mitochondrii, kde po inserci do mitochondriální membrány spouští procesy vedoucí k mitochondriální dysfunkci, uvolnění cytochromu c a dalších molekul do cytoplasmy a spuštění cesty mitochondriální smrti [21].

Dalšími molekulami, propojujícími vnější a vnitřní apoptotickou signální dráhu, jsou proteiny uvolňované po permeabilizaci mitochondriální membrány. Typickým příkladem je protein Smac/DIABLO, uvolňovaný z mitochondrií při apoptóze navozené signalizací přes receptory smrti. Tento protein interaguje s jedním z inhibičních proteinů apoptózy, proteinem XIAP, a sekvestruje jej. XIAP následně nemůže inhibovat kaspázy- 3 a -9, které tak podstoupí svou plnou proteolytickou aktivaci. Kaspáza-3 pak kromě dalších proteinů štěpí i XIAP, čímž usnadňuje apoptotickou zpětnou vazbu a celý systém funguje jako amplifikační smyčka ústící v nevratné spuštění apoptózy [17].

Zajímavou roli v propojení obou signálních drah má kaspáza-8, jinak dominantní signalizační kaspáza vnější dráhy. V in vivo studiích se ukázalo, že jejím hlavním aktivátorem může být kaspáza-6, neboť inhibice této kaspázy výrazně snížila aktivitu kaspázy- 8 a celkové nastartování apoptózy [6].

Propojení mezi vnější a vnitřní signální dráhou lze najít nejen na úrovni aktivace efektorových kaspáz, ale i v regulaci počátečních prvků signální dráhy. Typickým příkladem může být vícečetná funkce proteinu p53. Jako odpověď na poškození DNA, působí p53 nejen na vnitřní pro-apoptotické molekuly jako Bax či Puma, čímž aktivuje mitochodriální signalizační dráhu. p53 také upreguluje geny proteinů účastnících se vnější signální kaskády, např. geny pro FasL či killer/DR5 receptor smrti [5, 19].

4.2.5. Regulace apoptózy

V průběhu celé apoptotické kaskády existuje několik kontrolních mechanismů. Vzájemný poměr pro- a protiapoptotických složek pak předurčuje definitivní osud buňky  - viz tab. 2 [16].

Z hlediska spuštění či zastavení apoptózy jsou stěžejní proteiny tzv. Bcl-2 rodiny. Antiapoptotický protein Bcl-2  byl primárně nalezen v B-buňkách maligního lymfomu (B-cell lymphoma), odtud tedy pramení i jeho označení. Tato proteinová rodina zahrnuje asi 20 zástupců, kteří obsahují alespoň jednu ze čtyřech evolučně  konzervovaných BH-domén. Anti-apoptotickými členy této rodiny jsou vlastní protein Bcl- 2 a jemu strukturně velmi příbuzné proteiny Bcl-Xl, Bcl-w, A1 a Mcl-1. Mezi pro-apoptotické proteiny řadíme Bax, Bak, Bok, které obsahují tři z BH-domén (tzv. BH123 proteiny), a proteiny obsahující pouze jednu BH-doménu, jako jsou Bid, Bad a Bim (tzv. BH3-only proteiny).  Anti-apoptotické proteiny mohou zabránit buněčné smrti vyvázáním (sekvestrací) či neutralizací BH123 proteinů: v jejich struktuře najdeme tzv. hydrofobní „kapsičku“, která naváže BH3-doménu pro-apoptotických proteinů, a tím je inaktivuje. Bax vytváří s  Bcl-2 heterodimer s antiapoptotickým účinkem. Při zvýšené expresi Bax však vznikají homodimery bax/bax, které naopak apoptózu usnadňují. Právě poměr bcl- 2 a bax, někdy nazývaný „bcl-2/bax reostat“ je kontrolním bodem, po jehož  překročení je proces apoptózy již ireversibilní - viz obr. 4. [8, 16].

Dalším faktorem, který blokuje nástup buněčné smrti, mohou být tzv. inhibitory apoptózy (IAP). Jedná se o malé proteinové molekuly, které zabraňují aktivaci prokaspáz, a tak blokují nástup apoptózy těsně před zahájením rozkladové fáze [16, 26]. U člověka bylo popsáno osm typů těchto proteinů: HIAP-1 (Human inhibitor of apoptosis protein), HIAP-2, XIAP (X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein), NIAP (Neuronal apoptosis inhibitor protein), c-IAP1, cIAP2, survivin a livin. Nejlépe charakterizovaným a z hlediska inhibice apoptózy nejpotentnějším proteinem se zdá být XIAP. Tyto proteiny blokují apoptózu přímou vazbou a inhibicí některých kaspáz. Zvýšená exprese survivinu byla opakovaně potvrzena u mnoha typů nádorů (prs, střeva, prostata, melanom, neuroblastom, non-Hodgkinský lymfom, močový měchýř aj.). Byla také prokázána pozitivní souvislost s expresí těchto proteinů a progresí onemocnění [16, 26].

Další skupinou antiapoptotických proteinů jsou tzv. CARP proteiny. Jde o apoptotické inhibitory vážící a negativně regulující kaspázy- 8 a -10. Apoptózu inhibují  některé proteiny využívané viry pro obranu proti atace hostitelského organismu. Patří mezi ně negativní regulátory kaspáz, jako jsou proteiny crmA, P35 nebo v-FLIP [17]. 

Zatímco iniciace apoptotické kaskády závisí na aktivaci vnější a/nebo vnitřní signální dráhy, vlastní průběh apoptózy může být ovlivněn mnohými dalšími signálními kaskádami. Mezi nejdůležitější takové kaskády patří dráhy spojené s proteiny Myc, NF-kB, MAPK/JNK a PI-3K/AKT [17].

(i) Myc dráha. Tři dosud popsané lidské Myc proteiny regulují rychlost buněčného růstu a přechod mezi G1 a S fází buněčného cyklu. Zvýšená aktivita Myc proteinů sensitizuje buňky vůči pro-apoptotickým faktorům a vede zejména k aktivaci vnitřní mitochodriální signální dráhy a uvolnění cytochromu c do cytoplasmy. Jeden z Myc proteinů (c-Myc) také zřejmě pozitivně kooperuje s Fas receptory, a tedy s vnější signální dráhou. Tento protein také může navozovat poškození DNA, neboť aktivuje enzymy produkující kyslíkové radikály.

(ii) NF-kB je obecně považován za protein zprostředkující přežití buněk, nicméně se ukazuje, že v závislosti na typu působící noxy může hrát i proapoptotickou roli. NF-kB se projevuje antiapoptoticky za působení ionizujícího záření, chemoterapeutik a v přítomnosti ligandů receptorů smrti; pak aktivuje anti-apoptotické faktory jako XIAP, FLIP či Bcl-Xl. Na druhou stranu, za působení paclitaxelu, p53, virového proteinu LMP1, za fokální ischemie nebo při depleci růstových faktorů je jeho vliv proapoptotický.

(iii) Dráha MAPK kinázy JNK. JNK kináza je člen proteinové superrodiny tzv. MAPK kináz (mitogen-activated protein kinase), které obecně mají nezastupitelnou roli v mnoha buněčných událostech zahrnujících i kontrolu buněčného růstu či apoptózy. Signální dráha JNK kinázy se částečně jeví rozporuplně, nicméně přinejmenším v neuronech byl prokázán její proapoptotický vliv. JNK může mj. zvyšovat expresi proteinu p53 a Fas/FasL molekul, fosforylovat proapoptotický protein Bad nebo se nepřímo účastnit štěpení proteinu Bid.

(iv) AKT dráha. AKT kináza obecně zprostředkovává signály potencující přežití buněk. Zeslabuje přenos signálu a aktivaci v rámci vnitřní signální dráhy apoptózy, a to fosforylací proteinu Bad nebo inaktivací transkripčních faktorů normálně vedoucích k produkci proapototických faktorů, jako jsou Fas ligand či protein Bid. AKT kináza také aktivuje IKK kinázu, pozitivní regulátor NF-kB faktoru. AKT kináza se učastní zeslabování apoptotických dějů navozených deplecí extracelulárních signálních faktorů, oxidativním a osmotickým stresem, iradiací, ischemickým šokem či chemoterapeutiky.

Obr. 4. Vliv proapoptotických a antiapoptotických genů na tzv. bcl-2/bax reostat. Klener, 2002.  

Druhá část článku (metody detekce bude uveřejněna v pátém čísle Gynekologa).

Tato práce vznikla za podpory grantu IGA MZ, ČR, výzkumný projekt č. NR 9313-3/2007