Časopis ženských lékařů G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: redakce@gyne.cz

PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA A JEJÍ MÍSTO V SOUČASNÉ ASISTOVANÉ REPRODUKCI

Preimplantation genetic diagnosis and its importance for assisted reproduction

V. Bečvářová

Centrum reprodukční medicíny GEST, vedoucí lékař MUDr. M.Čekal, Praha 5, Nad Buďánkami II 24

Strukturovaný souhrn:

Cíl studie: Podat stručný přehled o principu a reálných možnostech preimplantační genetické diagnostiky (PGD) v současné asistované reprodukci

Typ studie: Přehledný článek

Název a sídlo pracoviště: Centrum reprodukční medicíny GEST, Nad Buďánkami II 24, Praha 5

Metodika: Souhrn literárních údajů (odborné časopisy, učebnice, přednášky, internet) a praxe v embryologické a genetické laboratoři

Závěr: Metoda PGD byla zavedena v asistované reprodukci přibližně před 10 lety. Jednotlivé používané metodiky jsou neustále zdokonalovány. Jednoznačný přínos má metoda pro páry s vysokým genetickým rizikem (translokace, strukturální přestavby chromozomů, monogenní choroby atd.). Pro páry s nižším genetickým rizikem má svůj význam, i když je její efekt zatím menší než se předpokládalo. Za účelem zjištění příčin probíhá podrobná analýza dat odbornými společnostmi.

Klíčová slova: preimplantační genetická diagnostika, biopsie blastomer, vyšetření aneuploidií, IVF pacienti s horší prognozou reprodukce, translokace chromozomů, mozaicismus

Structured abstract:

Objective: Brief survey of principles and possibilities of preimplantation genetic diagnosis (PGD) in comtemporary assisted reproduction

Design: Review article

Setting: GEST – centre of reproductive medicine, Prague

Methods: analysis of literary data ( medical journals, textbooks, lectures, internet) and experience in embryological and cytogenetical laboratory

Conclusion: PGD is used in assisted reproduction for approximately 10 years. The methodology is still evolving. PGD represents an advantageous clinical option especially for couples at high genetic risk (translocation, structural chromosomal rearrangements, monogenic diseases etc.). PGD is also beneficial for couples with lower genetic risk, because of prevention of repeated IVF failures and increasing of pregnancy rates. But this effect for low risk patients is not still as high as it has been supposed. The data are analysed by specialists to find reasons of it.

Key Words :preimplantation genetic diagnosis, blastomere biopsy, aneuploidy testing, poor-prognosis IVF patients, chromosomal translocation, mosaicism

1. Úvod

Obor asistované reprodukce zahrnuje v současné době mnoho medicínských a přírodovědných laboratorních postupů. Toto prolínání oborů a jejich vzájemná závislost jsou vedeny logickou snahou o zdokonalení jednotlivých metod léčby neplodnosti.

Nejčastěji používanou metodou této léčby je mimotělní oplodnění oocytů, tzv. in vitro fertilizace (IVF). Tato metoda vyžaduje kromě gynekologického zázemí i špičkově pracující embryologickou laboratoř. Přes striktní dodržení všech stávajících laboratorních standardů je úspěšnost asistované reprodukce a IVF do značné míry limitována úrovní dostupných znalostí. Z toho vyplývá i nutnost stále většího porozumění molekulární a buněčné biologii lidských gamet a raného embrya. Jedním z principů úspěšné léčby je co nejpřesnější selekce životaschopného embrya během kultivace in vitro.

Obecně jsou v IVF laboratořích úspěšně používána morfologická a růstová kriteria selekce embryí. Existují ale případy, kdy tato kriteria vůbec nekorelují s genetickým stavem embryí. Jsou to především embrya pacientů – nosičů chromozomálních přestaveb nebo molekulárních mutací. Proto se začala uplatňovat v indikovaných případech i tzv. preimplantační genetická diagnostika (PGD).

2. Definice a princip metody

Preimplantační genetická diagnostika je metoda kombinující embryologické a genetické laboratorní techniky za účelem vyšetření vzniklého embrya před jeho eventuelním zavedením do dělohy a následnou implantací. Tato metoda není využívána v laboratořích rutinně, ale má velký význam pro páry s tzv. horší genetickou prognózou reprodukce.

Principem metody je odběr 1 buňky (v některých případech i 2) a cílená genetická analýza jaderného materiálu. Podle výsledků v genetické laboratoři následuje výběr vhodných embryí k transferu pacientce.

Genetické vyšetření se dá provést na více úrovních. Jednak na zralém dosud neoplozeném oocytu, kdy analýzou 1. pólového tělíska (pólové buňky) získáme v podstatě zrcadlovou informaci o genetickém stavu jádra samotného oocytu. Tímto způsobem mohou být selektovány některé abnormální oocyty již před oplozováním. Jde však pouze o analýzu oocytu, tedy poloviny genetického materiálu embrya.

Navíc bylo zjištěno, že celá 1/3 detekovaných embryonálních abnormalit vzniká postmeioticky [14].

Proto většina laboratoří provádí vyšetření buněk embryí, a to na úrovni třídenního nebo pětidenního embrya (blastocysty). Protože transfer embryí z in vitro kultivace se dá provádět nejpozději 5. den (ojediněle 6. den) kultivace, preimplantační diagnostika pětidenního embrya je časově velmi napjatá, i když je možné při odběru získat více buněk a tím i více materiálu pro následnou genetickou analýzu. Nejčastěji používanou metodikou je PGD u třídenního embrya.

3. Vyšetření třídenního embrya metodou PGD

Třídenní lidské embryo je tvořeno obvykle 6 – 10 buňkami srovnatelné velikosti a funkce. Tento shluk buněk je obklopen vnějším nebuněčným obalem – zonou pellucidou. Vlastní odběr 1 nebo 2 buněk je pro embryo vysoce invazívní záležitost, kdy je nutné nejprve vytvořit v ochranném obalu otvor dostatečně velký k tomu, aby jím mohla být později vyjmuta neporušená embryonální buňka k analýze. Při tomto odběru nesmí být embryo nevratně poškozeno.

Zpracování odebrané buňky se děje podle plánované cílené genetické diagnostiky. Buď je embryologem fixována na podložní mikroskopické sklíčko k fluorescenční cytogenetické analýze (tzv. fluorescenční in situ hybridizace – FISH) nebo je odebraná buňka umístěna do sterilní zkumavky pro molekulárně genetickou analýzu (polymerázová řetezová reakce – PCR). Zvláště v tomto případě je nutno zdůraznit nezbytnost dodržení všech pravidel molekulárně genetické sterility, aby nebyl výsledek zkreslen nežádoucí biologickou kontaminací [19].

Ziskem 1 embryonální buňky je k dispozici velmi malé množství jaderné DNA k vyšetření (pikogramy). Odběr druhé buňky je vždy pečlivě zvažován, protože ten již může embryo nevratně poškodit [13]. Vzhledem k takto omezenému množství materiálu je vždy nutné preimplantační vyšetření embrya nějakým způsobem zacílit. Vědět přesně, co a proč potřebujeme o daném embryu vědět. Po provedení takového vyšetření nelze tudíž jednoznačně tvrdit, že přenášíme při transferu zdravá embrya. Přenášíme pouze embrya s normálním nálezem v daných vyšetřovaných parametrech.

4.Možné komplikace vyšetření a interpretace výsledků

V současné době, kdy mají pacienti daleko větší možnosti samovzdělání (internet, publicistika), by měla být věnována pozornost i objektivnímu pohovoru genetika s léčeným párem. Že jde o nezanedbatelnou součást postupu, je vidět i z doporučení PGD konzorcia Evropské společnosti pro lidskou reprodukci a embryologii (European Society of Human Reproduction and Embryology- ESHRE) [19]. Často se totiž stává, že pár není dostatečně informován i o možných problémech při interpretaci výsledků, účinnosti metod, možnosti jak falešně pozitivního, tak falešně negativního výsledku. Pokud není pár vhodně informován, není možné, aby se kompetentně rozhodl v souvislosti s indikací k vyšetření.

Jak již bylo zmíněno, odběr buňky k analýze je pro embryo invazívní výkon. Existuje více způsobů odběru buňky z embrya [4], přičemž každá laboratoř by měla mít zvládnutý tento postup tak, aby byl současně proveden optimálním způsobem odběr blastomery, její zpracování a zároveň byla zachována životaschopnost embrya. K jeho usnadnění provádějí některé laboratoře odběr buňky v tzv. ochuzeném kultivačním mediu. Není dosud zcela jasné, zda delší přítomnost embrya v těchto podmínkách nemá vliv na jeho další vývoj. Někteří autoři zaznamenali zpomalení vývoje takových embryí [4].

Při vyšetření pomocí FISH musí být brána v úvahu i existence mozaicismu v embryích, tzn. přítomnost více druhů buněčných linií s rozdílným genetickým nálezem v 1 embryu. Vzhledem k tomu, že výběr bioptované buňky je zcela náhodný, zjištěný výsledek může být falešně pozitivní i falešně negativní (udává se rozptyl 0,5 – 10%). Skutečný stav by teoreticky mohl být zjištěn až následnou reanalýzou celého embrya. Tento jev může být částečně eliminován biopsií 2 buněk. Dále může dojít při hodnocení ke zkreslení fluorescenčních signálů jejich vzájemným překryvem nebo vlivem horší fixace buňky na sklíčko. Takové signály není genetik schopen jednoznačně interpretovat. Stejně tak může dojít během zpracování a fixace ke ztrátě buněčného jádra (a tím DNA) k vlastní analýze [4], [19].

Při molekulárně genetickém hodnocení (PCR) mohou některé fyzikální a chemické jevy mezi molekulami zasáhnout do klíčové reakce natolik neodhadnutelně, že v závěru může být jak falešně pozitivní tak falešně negativní výsledek. Laboratoře řídící se doporučením a zkušenostmi PGD konzorcia ESHRE [19] mohou eliminovat tyto jevy tak, že účinnost klíčové analytické reakce je minimálně 90%. Kromě toho jsou molekulárně genetická vyšetření velmi citlivá na kontaminaci cizorodou DNA [7] .

5.Indikace k vyšetření embryí metodou PGD

PGD ještě není v oboru asistované reprodukce zcela rutinně používanou metodou. Bývá genetikem indikována u párů s horší genetickou prognózou reprodukce. Mezi ně patří jednak pacienti s vysokým rizikem přenosu genetických vad nebo defektů na potomky (např. chorob na pohlaví vázaných, autozomálně dominantně nebo recesivně děděných chorob) a páry, kde byla u jednoho z partnerů nalezena nějaká chromozomální abnormalita (translokace, inverze a podobné strukturální aberace). Udává se, že u párů, kde je 1 z partnerů nosičem nějaké strukturální přestavby chromozomů, je pouze asi 15 % embryí s normálním nebo balancovaným nálezem [2], [16]. Na druhé straně bývá PGD indikována ke zvýšení účinnosti IVF pro páry, kde je horší prognóza výsledku IVF v souvislosti s vyšším věkem ženy, opakovanými neúspěchy IVF léčby a aborty. V těchto případech se vyšetřuje možná přítomnost aneuploidií některých chromozomů v embryích. Účelem takové diagnostiky je eliminovat embrya obsahující polyploidie, nejčastěji nacházené trizomie nebo monozomie apod. ještě před transferem, a zvýšit tak pravděpodobnost otěhotnění a porodu zdravého dítěte. Tento typ vyšetření bývá nazýván PGS – preimplantation genetic screening.

U skupiny s vysokým genetickým rizikem je přínos PGD jednoznačný. Např. Munné [11] udává snížení rizika spontánního abortu u embryí nosičů translokací z průměrně 81 % bez PGD na 13 % po PGD. Je zřejmé, že v těchto případech převažuje přínos metody nad riziky uvedenými v kapitole č.4 [21], [5].

U skupiny pacientů s nižším genetickým rizikem (PGS) je práce klinického genetika zvláště důležitá. Pár by měl být objektivně informován o reálných možnostech i limitacích této diagnostiky. Genetik by měl vždy posoudit, co lze vyšetřit a s jakým profitem pro pár. Nutno vedle sebe vyčíslit spolehlivost metody v souvislosti s existencí některých již dříve jmenovaných rizik. U obou skupin by měli být pacienti informováni o tom, že embryologická laboratoř může ustoupit od provádění diagnostiky (např. při špatné kvalitě embryí, zástavě jejich růstu apod.), kultivaci přerušit, nebude-li počet vzniklých embryí splňovat statistickou pravděpodobnost nálezu embrya s normálním genetickým výsledkem atd. [19]. Embrya lze dočasně zamrazit za účelem shromáždění dalších embryí z více stimulovaných cyklů, aby bylo provedení PGD statisticky i medicínsky smysluplné. Např. Munné [18] doporučuje provádět PGS u cyklů, kde počet vzniklých embryí je minimálně 5. Právě v souvislosti s PGS jsou uváděny práce, kdy zvýšení úspěšnosti IVF cyklu nebylo takové, jaké bylo očekáváno [21], [22]. Naopak při vyšetření darovaných oocytů a z nich vzniklých embryí byl nález aneuploidií nečekaně vysoký (rozptyl 30 – 83%) a to bez závislosti na věku dárkyň [6], [15], [17]. Navíc se zatím v současné době technicky nedají vyšetřit všechny chromozomy bioptované buňky, ale většinou pouze ty, které jsou nejčastěji nacházeny u porodů s trizomií (tj. 13, 18, 21, X a Y) a u spontánních abortů (16, 22,15, 21) [18]. V porovnání s nejčastěji vyšetřovanou pěticí chromozomů (X, Y, 13, 18, 21) se vyšetřením dalších chromozomů diagnostika jistě zpřesní, ale podle uvedených citací je nejspíš nutno uvažovat i o jiných faktorech majících vliv na frekvenci aneuploidií u embryí než je věk žen [3]. Dokonce se udává, že provedení a neprovedení PGS u žen vyššího věku nemělo statisticky významný vliv na procento klinických gravidit [1], [22]. Dále je nutno si uvědomit, že podstatnou částí léčby a de facto dalším reálným pokusem o otěhotnění je využití kryokonzervace nadbytečných embryí vzniklých za stimulovaného cyklu IVF. Při PGD nebo spíše při PGS by se po genetickém vyšetření mrazila pochopitelně jen embrya s normálním nálezem. Problém je však v samotném procesu mrazení. Využívá se tu ochranné funkce obalu embryí - zony pellucidy. Při biopsii blastomery je do zony však vytvořen natolik velký otvor, že ta již ztrácí do značné míry svou ochrannou funkci. Uváděné výsledky s využitím kryokonzervace embryí po PGD analýze proto nejsou příliš dobré [19].

6.Diskuse

PGD byla původně vyvíjena pro vyšetření pohlaví embryí u párů, kde se vyskytují choroby vázané na pohlaví (1990 – 1992). Poté začala být šířeji užívána v letech 1993 – 1994 i pro vyšetření dalších chorob a během následujících let se vyvinula a rozšířila tak, že do současné doby bývá ve světových statistikách uváděno provedení více než 6 500 cyklů IVF ve spojení s PGD nebo PGS a víc než 1 000 narozených dětí. Podíl vrozených vad a malformací nepřevýšil populační riziko [21].

O počátek a vývoj metody se zasloužily především kolektivy lékařů a vědců vedené Yury Verlinskym ( Chicago, U.S.A.), Santiagem Munné (New Jersey, U.S.A.) a Lucou Gianarollim (Bologna, Itálie).

Jedná se o náročnou metodiku, kde je nutné dbát na přesné technicko-metodické zvládnutí a také na technické a finanční zabezpečení. Metoda je používána v podstatě 10 let a stále se vyvíjí a zpřesňuje. Nelze upřít její jednoznačný přínos pro léčené páry s vysokým genetickým rizikem, u kterých bez předchozí analýzy embryí je procento samovolných potratů po IVF extrémně vysoké [9], [12]. PGD pro ně znamená vlastně reálnou možnost přiblížit se úspěšnosti léčby neplodnosti, jaká je u párů s normálním genetickým nálezem.

V případě PGS je vždy třeba zvažovat s jakou úspěšností laboratoř pracuje a k tomu uvést přínosy a rizika. Nutno zmínit i následné problémy s kryokonzervací. Tento problém není příliš aktuální u párů s vysokým genetickým rizikem, neboť pravděpodobnost výskytu většího počtu embryí s normálním nálezem, která by mohla být následně kryokonzervována pro další transfer, je velmi malá.

7. Závěr

Význam PGD je nesporný. Spočívá v tom, že ji lze považovat za další metodu selekce vhodného embrya k transferu po IVF. Je přínosem především pro páry, kde jeden z partnerů pochází z rodiny s vážným genetickým zatížením. Těhotenství po IVF v kombinaci s PGD dává reálnou možnost vyhnout se ranému potratu nebo indukovanému předčasnému ukončení těhotenství v 2. trimestru v důsledku zjištěného nebalancovaného karyotypu plodu nebo přítomnosti mutantní alely. Indikace k PGD (PGS) pro páry s tzv. nižším genetickým rizikem se může lišit podle přístupu a názoru indikujícího genetika na šíři jejího využití. V této souvislosti je nutno vzít v úvahu, že problémy s vyhodnocením výsledků jmenované v kapitole č.4, se vyskytují v určité míře v každé laboratoři a jsou dány samotnou metodikou. Současně je si třeba uvědomit, že pomocí PGD je možno vyšetřit jen určité spektrum chorob a vad. Počet vyšetřitelných chorob se s každým rokem zvyšuje a metodiky vlastní práce se zpřesňují. Významnou roli hraje rovněž informovanost pacientů. Právě v tomto oboru, kde psychická stránka věci má při léčbě obrovský význam, je pár takto podstatně lépe připraven na rozhodování spojená s aktuálním stavem embryí a s výsledky genetického vyšetření během vlastního IVF cyklu. Prováděním tohoto typu vyšetření se prohlubuje kontakt center asistované reprodukce s genetickými pracovišti. Podaří-li se to s vzájemným respektem k reálným možnostem obou oborů a s využitím nejaktuálnějších vědeckých informací, bude to beze sporu k prospěchu všech pacientů.

Literatura

1. Anderson, A.R. et al. Age-Matched Comparison of PGD and Conventional Blastocyst Transfer, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P-599

2. Feyreisen, et al Robertsonian and Reciprocal Translocations: Is PGD a Realistic Treatment Option ?, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P-516,

3. Finn, A. et al. Differencial Delivery Rates Between Infertility Diagnosis in a PGD/FISH Programm, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P -501

4. Gardner, D.K., Weissman, A., Howles, C.M. et al. Textbook of Assisted Reproductive Techniques, 2nd Edition, Taylor & Francis 2004

5. Hill, D.L. Ten years of preimplantation genetic diagnosis – aneuploidy screening: review of a multicenter report. Fertility and Sterility, Vol. 82, No. 2, August 2004, p.300

6. Kearns, W.G. et al. Preimplantation Embryo Aneuploidy Rates in Couples Undergoing Donor Egg IVF Cycles, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P-507

7. Lewis, C.M., Pinel, T., Whittaker, J.C. Controlling misdiagnosis errors in PGD, Human Reproduction 16, pp 43 – 50, 2001

8. Magli, M. Embryo aneuploidies, Reproductive BioMedicine Online, Vol. 10, Supplement 2, May 2005, O-19

9. Munné, S., Sandalinas, M., Escudero, T. et al. Outcome of PGD of translocation. Fertility and Sterility vol. 73, No. 6, June 2000

10. Munné, S. PGD of structural abnormalities . Molecular and Cellular Endocrinology 183, S55 – S58, 2001

11. Munné, S., Escudero, T., Colls, P. et al. Predictability of PGD of aneuploidy and translocations on prospective attempts. Reproductive BioMed Online, Vol 9, No.6, 2004, pp 645 – 651

12. Munné, S., Escudero, T., Fischer, J. et al. Negligible interchromosomal efect in embryos of Robertsonian translocation carriers. Reprod BioMed Online, Vol. 10, No. 3, pp 363 – 369, 2005

13. Munné, S. et al. Results of PGD for infertility in 3 597 cycles, Reproductive BioMedicine Online, Vol. 10, Supplement 2, May 2005, O-37

14. Munné, S. et al. Maternal age is the most important parameter predicting aneuploidy, yet it is an unpredictable indicator of chromosome abnormalities, Reproductive BioMedicine Online, Vol. 10, Supplement 2, May 2005, O-38

15. Munné S. et al. Wide range of chromosome abnormalities in the embryos of young egg donors, Reproductive BioMedicine Online, Vol. 10, Supplement 2, May 2005, O-79

16. Munné, S. et al. PGD for chromosome structural aberrations: outcome and comparison, Reproductive BioMedicine Online, Vol. 10, Supplement 2, May 2005, O-81

17. Nelson, J.R. PGD in Embryos Created from Oocytes Donation, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P-492

18. Reprogenetics. dostupné na www.reprogenetics.com

19. Thornhill, A.R., deDie – Smulders, C.E., Geraedts, J.P., et al. ESHRE PGD Consortium Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening(PGS). Human Reproduction Vol. 20, No. 1, pp 35 – 48, 2004

20. Trounson, A. Research must continue on PGD methodologies. Fertility and Sterility, Vol. 82, No. 2, August 2004, p.299

21. Verlinsky, Y., Cohen, J., Munné, S., et al. Over a decade of experience with PGD. Fertility and Sterility, Vol. 82, No. 2, August 2004, p. 292 – 294

22. Werlin, L.B. et al. PGD as a Benefical Tool in Women with Reccurent Pregnancy Loss and Advanced Maternal Age, Fertility and Sterility, Vol. 84, Supplement 1, September 2005, P-496