Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: redakce@gyne.cz

VELIKOST VIROVÉ NÁLOŽE ONKOGENNÍCH TYPŮ HPV U CERVIKÁLNÍCH INTRAEPITELIÁLNÍCH NEOPLÁZIÍ

Viral load of oncogeneic types HPV in cervical intraepithelial neoplasia

L. Ševčík, P.Koliba,  M. Konderla, P. Gráf, J. Hlavačka

Porodnicko – gynekologická klinika FNsP Ostrava, přednosta MUDr. Peter Koliba, CSc.

Souhrn

Cíl studie: Zjistit velikost virové nálože onkogenních typů HPV (HR HPV) u různých stupňů cervikálních intraepiteliálních neoplázií.

Typ studie: Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště: Porodnicko – gynekologická klinika FNsP Ostrava.

Metodika: Do studie bylo zahrnuto 205 pacientek indikovaných ke konizaci pro cervikální intraepiteliální neoplázii. Před konizací byla provedena rozšířená kolposkopie, odběr cytologie, HPV DNA test a cílená biopsie. Podle závažnosti histopatologických nálezů  byly pacientky rozděleny do tří skupin. V těchto skupinách byla sledována  velikost virové nálože, rozdělená podle intenzity světelného signálu (RLU) do tří pásem a šesti skupin.

Výsledky: Histopatologický nález z celkového počtu 205 konusů tvořilo 5 (2 %) benigních lézí, 85 (41 %) CIN 1 , 77 (38 %) CIN 2 a 38 (19 %) CIN 3. HR HPV infekce byla prokázána ve 143 (70%) případech. U pacientek s benigní lézí nebyla HPV infekce prokázána.  Velikost virové nálože byla u CIN 1 negativní v 48 (56%) případech, v nízkém pásmu v 23 (27 %), ve středním pásmu v 11 (13 %) a ve vysokém pásmu v 3 (4 %) případech. U CIN 2 byla velikost virové nálože negativní v 9 (12%) případech, v 39 (51 %) případech byla v nízkém pásmu, v 25 (32 %) ve středním pásmu a ve 4 (5 %) případech v pásmu vysokém. Velikost virové nálože u CIN 3 byla negativní v 1 (3%) případě, v nízkém pásmu v 16 (42 %), ve středním pásmu ve 20 (52 %)  v pásmu vysokém v 1 (3 %) případě.

Závěr: Se stoupající závažností cervikální intraepiteliální neoplázie stoupá velikost virové nálože onkogenních typů virů.

Klíčová slova: cervikální intraepiteliální neoplázie, papillomavirus, HPV test,virová nálož

Summary

Objective: To investigate viral load of the high risk-oncogenic types of Human Papillomavirus ( HR HPV) in different grades of the cervical intraepithelial neoplasia (CIN).

Design: A retrospective study.

Setting: Department of Obstetric and Gynecology University Hospital Ostrava

Methods: 205 female patients indicated to conisation for cervical intraepithelial neoplasia were included into the study. Before conisation, an extended colposcopy with cytology sampling, HPV DNA testing and punch biopsy was performed. In all patients, a level of HR HPV viral load was examined. According to the severity of histopathological findings the patients were subdivided into three groups. The viral load divided into six groups and three zones was examined separately in different histopathological findings.

Results: Histopathology of 205 cone biopsies showed 5 (2%) benign lesions, 85 (41%) CIN 1, 77 (38%) CIN 2 and 38 (19%) CIN 3. HR HPV infection was detected in 143 (70%) of  cases. In patients with a benign lesion no HR HPV infection was found.

In CIN 1, the viral load was negative in 48 (56%) cases low in 23 (27%), moderate in 11 (13%) and high in 3 (4%) cases. In the CIN 2, the viral load was negative in 9 (12%), low in 39 (51%), moderate in 25 (32%) and high in 4 (5%) cases. In CIN 3, the viral load was negative in 1 (3%), low in 16 (42%), moderate in 20 (52%) and high in 1 (3%) cases.

Conclusion: The increasing severity of the cervical intraepithelial neoplasia is paralleled by an increased viral load of the HR HPV.

Key words: cervical intraepithelial neoplasia, papillomavirus, viral load HPV testing

Úvod

Genitální HPV infekce je nejčastější sexuálně přenosnou infekcí, která je etiologickým faktorem cervikální intraepiteliální neoplázie a cervikálního karcinomu. Spojitost cervikálního karcinomu se sexuální aktivitou je známa již více než 100 let, teprve techniky molekulární biologie však prokázaly úzký vztah HPV a karcinomu hrdla děložního. V posledních letech přibývá důkazů, že nezbytným a rozhodujícím krokem vzniku a progrese cervikální intraepiteliální neoplázie je perzistence onkogenních typů lidských papillomavirů. Perzistence HPV infekce je závislá na typu viru a velikosti virové nálože.

Cílem naší studie bylo zjistit velikost virové nálože HR HPV u různých stupňů cervikálních intraepiteliálních neoplázií.

Soubor a metodika

Studovaný soubor tvořilo 205 pacientek které byly v letech 1999-2001 na porodnicko-gynekologické klinice FNsP Ostrava indikovány ke konizaci. Věk se ve sledované skupině pohyboval v rozmezí 21-73 let, s mediánem 38 let.

Na základě komplexního vyšetření, po informovaném souhlasu pacientky, byla indikována konizace, která byla u všech pacientek provedena LEEP technikou.

Histologická diagnóza při vyšetření konusu byla konečnou diagnózou daného onemocnění, ke které jsme vztahovali všechny další diagnostické vyšetřovací metody, kolposkopii, cytologii a HPV test. Histologická diagnóza byla považována za negativní při nálezu  dlaždicobuněčné metaplázie, reaktivních změn nebo zánětlivých atypií. Při nálezu koilocytární atypie nebo lehké dysplázie byly změny označeny CIN 1, změny vyššího stupně jako CIN 2 a CIN3.

V jednotlivých skupinách cervikálních intraepiteliálních neoplázií jsme vyhodnocovali velikost virové nálože onkogenních typů HPV. Virová nálož byla rozdělena podle intenzity světelného signálu na tři pásma a šest skupin, kdy intenzita menší než 300 RLU byla považována za negativní výsledek.

HPV DNA test s vyhodnocením velikosti virové nálože byl prováděn hybridizační metodou firmy Digene Diagnostics. Hybride Capture Systém II je signál amplifikující sendvičová molekulárně hybridizační metoda, využívající chemiluminiscentní detekce. Metoda je schopná identifikovat l4 nejčastějších genotypů anogenitální oblasti. Koktejlové sondy rozliší 5 nízce rizikových typů (6, 11, 42, 43, 44) a 9 onkogenních typů (16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 a 56). Vzorek obsahující terčík virové DNA je v hybridizační zkumavce nejprve smíchán s denaturačním činidlem, přičemž dochází k rozpojení dvouvláknité šroubovice DNA viru. Po té je do hybridizační zkumavky přidán kombinovaný sondový koktejl jednovláknových RNA prob nebo při typizaci HPV DNA proba jednoho genotypu. Dochází ke spojení komplementárních vláken a k vytvoření DNA–RNA hybridu. Tento hybrid je vychytáván protilátkou proti DNA–RNA hybridu, která je na vnitřním povrchu zkumavky. Imobilizovaný hybrid dále reaguje s protilátkou proti hybridu, která je konjugována s alkalickou fosfatázou a chemiluminiscentním substrátem. Imobilizovaný hybrid při reakci uvolňuje světelné částice a ty mohou být měřeny jako relativní světelné jednotky (RLU) luminometrem. Intenzita emitovaných fotonů vyjádřena velikostí číselného signálu je přímo úměrná velikosti terčíku virové DNA ve vzorku. Pozitivní světelná reakce tedy znamená přítomnost virové DNA ve vzorku odebraného ze sliznice čípku děložního.

Zároveň umožňuje tento test detekování jiných infekčních agens jako Chlamydia trachomatis a Neisseria gonorrhoeae. Citlivost zkumavkového Hybrid capture systém I byla 106 kopií na 1 ml testovaného vzorku, u mikrodestičkového systému Hybrid Capture systému II, který jsme používali v naší studii, je citlivost 102 kopií na 1 ml testovaného vzorku. Test zaručuje detekci 5 tisíc kopií HPV genomu ve vzorku, což je citlivost srovnatelná s PCR technikou.

Výsledky jsme statisticky zpracovali neparametrickým testem Χc2 a Fischerovým exaktním testem.

Výsledky

Histopatologický nález z celkového počtu 205 konusů tvořilo 5 (2 %) benigních lézí, 85 (41 %) CIN 1 , 77 (38 %) CIN 2 a 38 (19 %) CIN 3. (tab.1) HPV infekce byla prokázána celkem u 145 (71%) pacientek. Podle intenzity světelného signálu, udávaného v relativních světelných jednotkách (RLU), jsme pacientky rozdělili do sedmi skupin a tří pásem. (tab. 2) Intenzita signálu menší než 3OO RLU byla považována za negativní pro přítomnost HPV DNA.

Ve skupině benigních lézí  nebyla HPV DNA prokázána ani v jednom případě. Velikost virové nálože byla u CIN 1 negativní ve 48 (56%) případech, v nízkém pásmu ve 23 (27 %), ve středním pásmu v 11 (13 %) a ve vysokém pásmu v 3 (4 %) případech. U CIN 2 byla velikost virové nálože negativní v 9 (12%) případech, v 39 (51 %) případech byla v nízkém pásmu, ve 25 (32 %) ve středním pásmu a ve 4 (5 %) případech v pásmu vysokém. Velikost virové nálože u CIN 3 byla negativní v 1 (3%) případě, v nízkém pásmu v 16 (42 %), ve středním pásmu ve 20 (52 %) v pásmu vysokém v 1 (3 %) případě. (tab. 3), (graf 1-4) Při hodnocení velikosti virové nálože HR HPV u jednotlivých histologických skupin byla zjištěna statistická významnost na hladině významnosti p < 0,001.

Diskuse

Fenotypická exprese viru je závislá na genotypu viru, typu epitelu, hostitelské genetické predispozici a imunitní připravenosti [30]. Prevalence HPV infekce je mnohem větší než prevalence karcinomu hrdla děložního, jinými slovy, mnohem více žen je infikováno HPV infekcí, než žen s karcinomem. Znamená to, že proces karcinogeneze je multifaktoriální a kaskádový proces, ve kterém se kromě hlavního etiologického faktoru, papillomaviru, uplatňují další karcinogeny a kokarcinogeny. Všechny poznatky a výsledky studií vedou k molekulárnímu modelu HPV indukované karcinogeneze, při které dochází k interakci viru s hostitelskou buňkou. V genetickém systému buňky dochází ke změnám v tumor supresorových genech nebo buněčných onkogenech, které kontrolují buněčnou proliferaci a DNA syntézu [37, 38].

Imunitní systém ovlivňuje pochody na celulární nebo humorální úrovni. Regrese, perzistence nebo progrese je pak výsledkem této složité a vícestupňové interakce.

V posledních letech přibývá epidemiologických a molekulárně biologických důkazů, že perzistence onkogenních typů HPV je rozhodujícím momentem cervikální karcinogeneze, kdy po aktivaci buněčných onkogenů nebo inaktivaci tumor supresorových genů dochází k  buněčné imortalizaci a trasformaci v maligní buněčný fenotyp [12, 14, 15, 33]. Většina HPV infekce je přechodná, během čtyř až dvanácti měsíců je eliminovaná imunitními mechanismy hostitele [23]. Případná progrese je způsobená perzistencí virové infekce, která je podmíněna  typem viru a velikosti virové nálože na straně jedné a imunitních a genetických mechanismech hostitele na straně druhé.

Na kvantitativní hodnocení HPV pozitivity a vztahu mezi persistující infekcí a cervikální intraepiteliání neoplazií neexistují shodné názory. Sun [39] ve své studii neprokazuje u jednotlivých stupňů CIN rozdílné velikosti virové nálože. Naopak Cox, Cuzick, , Ferenzy, Ho, a Schneider [5, 6, 15, 35, 36] prokazují přímý vztah mezi velikostí virové nálože a závažnosti cervikální intraepiteliální neoplázie. Ke stejným závěrům dochází i studie Clavelové [4], avšak se závěrem, že kvantifikace virové nálože HR HPV nemůže být považována za validní test k vyčlenění cervikální intraepiteliální neoplázie vyššího stupně. K podobným závěrům docházíme i v naší studii. Velikost virové nálože byla větší u lézí vyšších stupňů než u lézí nízkého stupně nebo lézí benigních.

Naše studie ve shodě s jinými autory podporuje představu, že perzistence virové infekce, jako rizikový faktor progrese cervikální intraepiteliální neoplázie, je ovlivněna velikostí virové nálože. U cervikálních intraepiteliálních neoplázií vyššího stupně byly zaznamenány vyšší hladiny virové nálože. Měření hladin virových náloží je však nespolehlivé, neboť je ovlivňováno mnoha faktory, jako je  počet virových kopií na buňku, velikost léze a adekvátnost odběru vzorku. Proto si myslíme, že přestože může být velikost virové nálože biologickým markerem progrese léze, není zatím klinická užitečnost měření virové nálože  prokázána.

Závěr

U lézí vyšších stupňů je častěji přítomná vyšší virová nálož. Tato skutečnost je v souladu s modelem cervikální karcinogeneze, kdy perzistence HR HPV nutná pro pokračování procesu je častější a snazší při vyšší virové náloži.

Tuto skutečnost lze využít jen jako doplňkovou charakteristiku biologického chování léze, nelze podle velikosti virové nálože stanovovat stupeň léze či pravděpodobnost progrese procesu.

Literatura

1.Adam, E., Berková, Z., Daxnerová, Z. et al.: Papillomavirus detection: demographic and behavioral characteristic influencing the indentification of cervical disease. Am. J. Obstet. Gynecol., 182, 2000, 257-264.

2.Adam, E., Kaufman, R. H., Berková, Z. et al.: Is HPV testing an effective triage method for detection of high grade (grade 2 or 3) CIN? Am. J. Obstet. Gynecol., 178, 1998, 1235-1244.

3.Bosch, F. X., Manos, M. M., Munoz, N. et al.: Prevalence of HPV in cervical cancer: a worldwide perspective. J. of the nat. Cancer inst., 87, 1995, 796-802.

4.Clavel, Ch., Bory, J-P., Rihet, S. et al.: Comparative analysis of human papillomavirus detection by hybrid capture assay and routine cytologic screening to detect high-grade cervical lesions. Int. J. Cancer., 75, 1998, 525-528.

5.Cox, J. T., Lorincz, A. T., Schiffman, M. H. et al.: HPV testing by hybrid capture apperars to be usefull in triaging women with a cytologic diagnosis of atypical squamous cells of undeterminet significants. Am. J. Obstet. Gynecol., 172, 1995, 946-954.

6.Ferenczy, A.: Viral testing for HPV infections: recent progress and clinical potentials. Int. J. Gynecol. Cancer, 5, 1995, 321-328.

7.Franco, E. L., Ferenczy, A.: Assessing gains in diagnostic utility when HPV testing is used as an adjunct to Papanicolaou smear in the triage of women with cervical cytologic abnormalities. Am. J. Obctet. Gynecol., 181, 1999, 382-386.

8.Franco, E. L., Rohan, T. E., Villa, L. L. et al.: Epidemiologic evidence of human papillomavirus evidence as a necessary cause of  cervical cancer. J.Natl. Cancer Inst., 91, 1999, 506-511.

9.Franco, E. L.: Cancer causes revisited: HPV and cervical neoplasia. J. of the National cancer inst., 87, 1995, 779-780.

10. Hall, S., Lorincz, A., Shah, F. et al.: HPV DNA detection in cervical specimens by hybrid capture: Correlation with cytologic and histologic diagnoses of squamous intraepithelial lesions of the cervix. Gyn. Oncology, 62, 1996, 353-359.

11. Hatch, K. D., Schneider, A., Abdel-Nour, M. W.: An evaluation of HPV testing for intermediate and high risk types as triage before colposcopy. Am. J. obstet. Gynecol. , 172, 1995, 1150-1157.

12. Herrington, C. S., Evans, M. F., Hallam, N. F. et al.: HPV status in the prediction of high – grade CIN in patients with persistent low – grade cervical cytological abnormalities. Br. J. Cancer, 71, 1995, 206-209.

13. Herrington, C. S., Wells, M.: Can HPV typing predict the behaviour of cervical epithelial neoplasia? Histopathology, 31, 1997, 301-303.

14. Hildesheim, A., Schifman, M. H., Gravitt, P. E. et al.: Persistence of type-specific human papillomavirus among cytologically normal women. J. Inf. Dis., 169, 1994, 235-240.

15. Ho, G. Y. F., Burk, R. D., Klein, S. et al.: Persistent genital HPV infection as a risk factor for persistent cervical dysplasia. J. Nat. Cancer Inst., 87, 1995, 1365-1371.

16. Holub, Z., Lukáč, J., Chvalová, M. et al.: Hodnocení úlohy HPV testu v běžné klinické praxi: prospektivní studie. Česká gynekologie, 64(4), 1999, 238-241

17. Jenkins, D., Shelav-Johnson, Ch., Gallivan, S.: Can papillomavirus testing be used to improve cervical cancer screening? Int. J. Cancer, 65, 1996, 768-773.

18. Kaufman, R. H., Adam, E., Icenogle, J. et al.: Relevance of HPV screening in management of cervical intraepithelial neoplasia. Am. J. obstet. Gynecol., 176, 1997, 87-92.

19. Kaufman, R. H., Adam, E.: Is HPV testing of value in clinical practice? Am. J. Obstet. Gynecol., 180, 1999, 1049-1053.

20. Kiviat, N. B., Koutsky, L. A.: Specific HPV types as the causal agents of most cervical intraepithelial neoplasia: inplications for corrent views and treatment. J. Natl. Cancer Inst., 85, 1993, 934-935.

21. Kiviat, N.: Natural history of cervical neoplasia: Overview and update. Am. J. Obstet. Gynecol., 175, 1996, 1099-1104.

22. Kjaer, S. K., van den Brule, A. J. C., Bock, J. E. et al.: Human papillomavirus - the most significant risk determinant of cervical intraepithelial neoplasia. Int. J. Cancer, 65, 1996, 601-606.

23. Kjellberg, L., Wang, Z., Wiklund, F. et al.: Sexual behaviour and papillomavirs exposure in cervical intraepithelial neoplasia: a population-based case-controlled study. J Gen.Virol., 80, 1999, 391-398.

24. Koutsky, L. A., Holmes, K. K., Critchlow, C. W. et al.: A cohort study of the risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in relation to papillomavirus infection. The new England J. Of Med., 327, 1992, 1272-1278.

25. Koutsky, L.: Epidemiology of HPV infection. Am J. Med., 102, 1997, 3-8.

26. Ledger, W. J., Jeremias, J., Witkin, S. S.: Testing for high-risk HPV types will become a standard of clinical care. Am. J. Obstet. Gynecol., 182, 2000, 860-865.

27. Lorincz, A. T., Reid, R., Jenson, A. B. et al.: HPV infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet. Gynecol., 79, 1992, 328-337.

28. Morrison, E. A. B., Ho, G. Y. F., Vermund, S. H. et al.: HPV infection and other risk factors for cervical neoplasia: a case - control study. Int. J. Cancer, 49, 1991, 6-13.

29. Namkoong, S. E.: Clinical Application of HPV Typing in Cervical Cancer. Int. J. Of Gyn. and Obstetrics, 49 Suppl., 1995 , S59-S67.

30. Park, J. S., Hwang, E. S., Park, S. N. et al.: Physical status and expression of HPV genes in cervical cancers. Gyn. Oncology, 65, 1997, 121-129.

31. Redecha, M., Korbeľ, M., Nižňanská, Z. et al.: Veková charakteristika žien s prekancerózami a karcinómom krčka  maternice. Slov. Gynekol. Pôrod., 8, č. 4, 2001, 164-169.

32. Reid, R., Greenberg, M. D., Lorincz, A. et al.: Should cervical cytologic testing be augmented by cervicography of HPV DNA detection? Am. J. Obstet. Gynecol., 164, 1991, 1461-1471.

33. Remmink, A. J., Walboomers, J. M. M., Helmerhorst, T. J. M. et al.: The presence of persistent high risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. Int.J. Can., 61, 1995, 306-311.

34. Schiffman, M. H., Bauer, H. M., Hoover, R. N. et al.: Epidemiologic evidence shoving that HPV infection causes most cervical intraepithelial neoplasia. J. Natl. Cancer inst., 85, 1993, 958-964.

35. Schneider, A., Zahm, D. M., Greinke, Ch. et al.: Different detectability of high-risk HPV smears from incident and prevalent high-grade squamous intraepithelial lesions of the cervix. Gynecologic Oncology, 65, 1997, 399-404.

36. Schneider, A., Zahm, D. M., Kirchmayr, R. et al.: Screening for cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3: validity of cytology study, cervicography and HPV detection. Am. J. Obstet. Gynecol., 174, 1996, 1534-1541.

37. Southern, S. A, Herrington, C. S.: Molecular events in uterine cervical cancer. Sex. Trans. Inf., 1998, 74, 107-109.

38. Stoler, M. H.: HPV and cervical neoplasia: A model for carcinogenesis. Int. J. Gynecol. Pathol., 19, 2000, 16-28.

39. Sun, X. W, Ferenczy, A., Johnson, D. et al.: Evaluation of the hybrid capture human papillomavirus deoxyribonucleic acid detection test. Am. J. Obstet. Gynecol., 173, 1995, 1432-1437.

40. Syrjänen, K. J., Syrjänen, S. M.: HPV typing as an adjunct to cervical cancer screening. Cytopathology, 10, 1999, 8-15.

41. Vassilakos, P., de Marval, F. et al.: Human papillomavirus DNA assay as an adjunct to liquid-based pap test in the diagnostic triage of women with abnormal Pap smear. Int. J. Gyn. Obstet., 61, 1998, 45-50.

42.                       Vonka, V.: Lidské papillomaviry: jejich role při vzniku lidských nádorů a možnosti vývoje očkovacích látek. Remedia, Klin.mikrobiologie, 1, 1997, 206-212.

43. Walboomers, J. M. M., Jacobs, M. V., Manos, M. M. et al.: Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worl wide. J.Pathol., 189, 1999, 12-19.

44. Wright, T. C., Sun, X. W., Koulos, J.: Comparison of management algorithms for the evaluation of women with low-grade cytologic abnormalities. Obstet. Gynecol., 85, 1995, 202-210.

Tab. 1. HR HPV test v jednotlivých histologických skupinách

Tab. 2. Velikost virové nálože HR HPV v jednotlivých histologických skupinách (skupiny)

Tab. 3. Velikost virové nálože HR HPV v jednotlivých histologických skupinách (pásma)

Graf 1: Velikost virové nálože HR HPV ve skupině CIN 1.

Graf 2: Velikost virové nálože HR HPV ve skupině CIN 2.

Graf 3: Velikost virové nálože HR HPV ve skupině CIN 3.

Graf 4: Velikost virové nálože HR HPV v jednotlivých histologických skupinách