Časopis ženských lékařů G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: info@gyne.cz
Faltusová,
K.
IVF
centrum, PPCHC Sanus, Hradec Králové, přednosta MUDr. Jiří Štěpán, CSc.
Metoda
in vitro fertilizace / IVF /, ať již klasická nebo intracytoplazmatická
injekce spermie do oocytu / ICSI /, patří dnes k běžně užívaným
postupům při léčbě sterility. Od dob, kdy začala
být metoda IVF používána, se postupně prodlužuje doba kultivace
embryí / přesněji preembryí / v laboratoři, dříve než jsou
transferována do dělohy pacientky. Tento pokrok byl podmíněn zavedením
sekvenčních médií, která svým složením odpovídají metabolickým potřebám
preembrya v jeho různých fázích vývoje. Domníváme se, že kultivace
do stadia blastocysty celý proces co nejvíce přibližuje fyziologickým podmínkám
a dává tudíž naději na maximální úspěšnost z hlediska implantace
preembrya a vzniku gravidity.
Soubor,
který je předmětem této studie, tvoří 132 pacientek ve věku 21 – 44
let, jak s primární, tak sekundární příčinou sterility. Ženy jsme
stimulovali v krátkém / KAP / nebo dlouhém analogovém protokolu / DAP
/. Blokádu endogenních gonadotropinů jsme v případě KAP realizovali
Synarelem či Suprefactem, v případě DAP Decapeptylem depot. Pro
stimulaci ovarií jsme použili následující preparáty: Fostimon / vysoce čištěný
FSH /, Metrodin – HP / vysoce čištěný FSH /, Gonal – F / rekombinantní
FSH / a Puregon / rekombinantní FSH /. Při ultrazvukovém nálezu nejméně
jednoho folikulu o průměru 18 mm jsme podávali 10 000 j. hCG v preparátu
Pregnyl. 36 hod. poté jsme provedli aspiraci oocytů. Získané oocyty /den 0
kultivace/ jsme preinkubovali přibližně 4 hod. před přidáním spermií při
použití klasické metody IVF, kterou jsme volili v případě
normospermiogramu partnera nebo u méně výrazné oligo-, astheno- či
teratospermie. U závažnějších poruch spermiogramu jsme vybrané nejkvalitnější
spermie injikovali do oocytů /metoda ICSI /. Někdy jsme přistoupili ke
kombinaci obou metod – u hraničního nálezu ve spermiogramu a dostatečném
počtu oocytů.
Oplozené
oocyty jsme dále inkubovali /media Scandinavian IVF Science/ a v den 3 ráno
kultivace jsme hodnotili morfologickou kvalitu vzniklých embryí. Podle ní
jsme rozhodovali o způsobu prodloužené kultivace. Pokud jsme získali alespoň
dvě embrya o počtu 6 – 8 blastomer s kvalitní transparentní
cytoplazmou buněk a bez fragmentací v perivitelinním prostoru, mohli
jsme přistoupit ke kultivaci do stadia blastocysty, event. kompaktace /, které
stadiu blastocysty předchází / a k embryotransferu do dělohy pacientky
v den 5 kultivace. U stadia blastocysty se jednalo o několik vývojových
fází embrya : kavitaci, časnou blastocystu, expandující či plně
expandovanou blastocystu [1]. V případě nálezu méně kvalitních embryí
/pomalejší rýhování, přítomnost fragmentací, nekvalitní
cytoplazma blastomer / jsme transferovali do dělohy již v den 4
kultivace, a to embrya ve stadiu rýhování, obvykle minimálně 7 – buněčná,
případně moruly nebo kompaktace nižší kvality nebo ojediněle se vyskytující.
Zaváděli jsme 1 – 3 embrya v závislosti na počtu získaných embryí
požadované kvality, na anamnéze a přání pacientky.
Po
embryotransferu pacientky pokračovaly v užívání progesteronu v preparátu
Utrogestan / 3x denně 2 tbl. vag. /, se kterým započaly již v den
aspirace oocytů / v dávce 3x1 tbl. vag./ a Prednisonu / v dávce
½ - 0 – 1 tbl. /.
Graf
1 dokládá hodnoty pregnancy rate / PR /, tzn. procentuální počty pacientek
s klinickým těhotenstvím, ve třech skupinách podle typu transferovaných
embryí. V první jsme 32 ženám
zaváděli embrya ve stadiu rýhování, otěhotnělo 8 z nich. Ve druhé skupině
tvořené 50-ti pacientkami jsme transferovali 1 – 3 embrya tak, že nejméně
jedno z nich bylo ve stadiu kompaktace. Pokud jsme tedy zaváděli dvě
nebo tři embrya, nejednalo se vždy o kompletní sestavu kompaktací, ale jedno
nebo dvě embrya se mohla nacházet i ve fázi rýhování. Klinickou graviditu
jsme zaznamenali u 23 žen této skupiny. Třetí sloupec vyjadřuje pregnancy
rate opět 50-ti členné skupiny pacientek, tentokrát však při transferu
nejméně jedné blastocysty. Analogicky jako v předchozím případě,
transferovaná embrya při počtu 2 – 3 nebyla vždy kompletně ve fázi
blastocysty, ale u některých žen jsme zaváděli kombinace blastocyst a
kompaktací, event. se vyskytla i embrya ve stadiu rýhování. Otěhotnělo opět
23 pacientek.
Graf
2 srovnává pregnancy rate při transferu dvou a tří blastocyst. V první
skupině / transfer dvou blastocyst / zastoupené 10-ti ženami otěhotnělo 6 z
nich, ve druhé /transfer tří blastocyst /,12-ti členné, jsme zaznamenali 5
gravidit.
Graf
3 a 4 porovnává výsledky z hlediska počtu gestačních váčků po
transferu 1 – 3 embryí, která se nacházela výhradně ve stadiu kompaktace
/graf 3/ nebo blastocysty /graf 4/. Tyto soubory byly 9 – 12 členné.
Transferovat
embryo ve stadiu blastocysty do dělohy je nejvýhodnější strategie při
embryotransferu. Oproti zavádění časnějších vývojových fází pro tuto
cestu hovoří několik skutečností. V případě blastocysty
transferujeme zralejší embryo, a to navíc v době, kdy je endometrium již
dokonaleji připraveno pro jeho přijetí. Přibližujeme se totiž více
implantačnímu oknu spojenému s produkcí rozličných endometriálních
faktorů proteinové povahy, které podmiňují uterinní receptivitu
charakterizovanou schopností dovolit nejen adhezi a invazi embrya, ale i jeho
růst a vývoj. Navíc v době implantačního okna je škála těchto
proteinů, pro jejichž uplatnění je nutný pokles estrogenových a
progesteronových epiteliálních receptorů, pestřejší [2]. Vytváříme tak
příznivější předpoklady pro navázání kvalitní komunikace mezi
trofoblastem embrya a epitelem endometria, která se projeví v procesu
adheze a následné invaze embrya do děložní sliznice. Výsledkem je nárůst
pregnancy a implantation rates oproti situaci, kdy zavádíme embrya ve stadiu rýhování.
Transfer blastocyst je záležitostí fyziologičtější, plně ověřenou
evolučním vývojem.
Zavedení
embryí ve stadiu rýhování do dělohy s sebou přináší řadu nevýhod.
Předčasné uložení embrya do dělohy může vyústit v signifikantní
buněčný stres, který je následován poškozeným vývojem a ztrátou životaschopnosti
embrya [3], dochází k jeho nutričnímu a homeostatickému stresu. Při
transferu embryí v časnějších stadiích rýhování se zatím nestačil
realizovat vlastní embryonální genom a my nemáme možnost posoudit, zda
embryo bude mít skutečně plnohodnotný vývojový potenciál [4], zatímco fáze
blastocysty již zaručuje, že do
funkce vstoupila vlastní embryonální kontrola genomu [5]. Uterinní
kontrakce, které jsou nejsilnější v den aspirace oocytů / den 0 / a
mohou způsobit vyloučení embrya a jeho ztrátu, klesají v den 4. I z tohoto
důvodu je blastocystový transfer v den 5 kultivace bezpečnější [6].
Také nedostatečná přítomnost endometriálních faktorů v čase
transferu embrya ve fázi rýhování je svázána se selháváním procesu
implantace. Luminální strana endometriálního epitelu vytváří bariéru pro
embryo v době mimo implantační okno [2]. I tento problém může
vstupovat do hry při předčasném transferu.
Endometrium,
historicky považované za pasivní orgán, je ve skutečnosti orgánem velmi
aktivním, podléhajícím hormonální regulaci. Produkuje cytokiny a růstové
faktory, jsou zde lokalizovány četné receptory, které jsou kontrolovány
jednak endokrinně /hormonálně/, jednak parakrinně a autokrinně /cytokiny, růstové
faktory/. Steroidní hormony iniciují kaskádu molekulárních dějů, do níž
jsou zahrnuty cytokiny /leukaemia inhibitory factor, interleukin –1/, růstové
faktory /epidermal growth factor a jemu příbuzné molekuly / a molekuly buněčné
adheze. Jejich prostřednictvím komunikuje embryo s endometriem v procesu
implantace, jež zahrnuje tři fáze – apozici, adhezi a invazi embrya
[2,7,8]. Je zajímavé, že blastocysta sama uvolňováním svých faktorů /interleukin–1/
reguluje uterinní receptivitu [9].
Jednou
z forem vzájemné souhry embrya a děložní sliznice je schopnost apoptózy,
kterou indukuje blastocysta ve fázi adheze v místě implantace jakožto
nutný předpoklad překonání epiteliální bariéry a následné invaze do
endometria [10]. Apoptóza byla pozorována i v epitelu žlázek děložní
sliznice na začátku implantačního okna, zřejmě v souvislosti s přípravou
na přijetí embrya [11]. Receptivita endometria je podmíněna i strukturálně
– apikální části plazmatické membrány epitelu děložní sliznice vytvářejí
v období maximální receptivity jemné ultrastrukturální výběžky,
tzv. pinopodia, jejichž vznik je iniciován hormonálně. Blastocysty přednostně
adherují na plochách vykazujících pinopodia, tyto jemné výběžky však zřejmě
přímo neparticipují na adhezi. Bylo zjištěno, že u stimulovaných cyklů
se pinopodia objevují o 1 – 2 dny dříve než u přirozených cyklů [12]. Důležitou
roli v přípravě sliznice na implantaci zastupuje i proces angiogeneze a
s ním spjaté růstové faktory [13].
Z výše
uvedených fakt vyplývá, že přijetí embrya endometriem je složitý a
citlivý mechanismus, jehož podmínky musíme zvažovat, rozhodujeme-li se mezi
transferem blastocyst a časných embryí.
Závažnou
otázkou při kultivaci do stadia blastocysty je volba selekčních kritérií
za účelem výběru kompetentních embryí schopných ve svém vývoji dospět
do této fáze. Někteří autoři se domnívají, že jejich kvalitu lze
predikovat již velmi časně, např. u oocytů
z morfologie 1. pólového tělíska nebo z počtu a distribuce
jadérkových prekurzorových tělísek v prvojádrech oplozeného oocytu
[14,15]. Při volbě vlastních selekčních kritérií jsme na našem pracovišti
upřednostnili morfologii embryí v den 3 ráno kultivace. Předlohou nám
byly práce Chana a spol. [16] a Boostanfara a kol. [17]. Limitem pro dosažení
fáze blastocysty jsou podle Chana nejméně 6 – buněčná embrya ráno v den
3 kultivace, podle Boostanfara alespoň tři 8 – buněčná embrya. Nám se
osvědčil požadavek nejméně dvou 6 – buněčných embryí, která splňovala
obecně přijímané aspekty kvality – tzn. byla prosta fragmentací v perivitelinním
prostoru a cytoplazma blastomer se jevila homogenní, transparentní. Naše kritéria
jsou v souhlase s prací Abaého a kol. [18], kde autoři vypočítávali
tzv. den 3 embryo index a prací Schoolcrafta [19]. Uvedená hlediska kvality
plně pokryla naše nároky, pokud se v den 3 ráno kultivace embrya nacházela
v 6 – buněčném stadiu, bez problémů jsme dosahovali fáze kompaktace ke
dni transferu do dělohy, u 8 – buněčných embryí se pak jednalo převážně
o blastocysty. Pacientkám, u nichž nebyla splněna uvedená hraniční kritéria,
jsme zaváděli embrya nižšího stupně vývoje. Touto selekcí a rozdělením
pacientek do dvou podskupin podle typu kultivace se nám nesnížil celkový počet
transferů. Přestože u většiny žen se podařilo vykultivovat alespoň jedno
embryo ve stadiu nejméně kompaktace, domnívám se, že by nebylo správné
stanovit si tento požadavek obecně u všech pacientek. Podle mého názoru lze
z morfologie v den 3 ráno kultivace poměrně kvalitně, i když ne
zcela se zárukou, usuzovat na další vývoj embryí. Obecně totiž platí, že
schopnost embrya dosáhnout určitého stadia rýhování a fáze blastocysty k danému
časovému limitu koreluje s jeho životaschopností. Na druhou stranu je
zapotřebí počítat s faktem, že některé in vitro vzniklé blastocysty,
jevící se morfologicky zcela normální, nemusí být životaschopné. Mohou být
aneuploidní, metabolicky defektní, mohou postrádat buňky embryoblastu, mohou
být neschopné spontánního hatchingu nebo deficientní v sekreci choriového
gonadotropinu [20]. Ne všichni autoři jsou však přesvědčeni o přínosu
den 3 morfologie embryí pro predikci jejich kvality [21], i když tento názor
se objevuje spíše ojediněle.
Ve
snaze redukovat vícečetná těhotenství a jeho rizika se postupně snižuje
počet embryí k transferu. Tento
trend je spjat s potřebou vybrat embrya co nejkvalitnější, s předpokládanou
dobrou životaschopností. Ta je spolehlivěji předvídána při dostatečně
dlouhé kultivaci, kterou dovoluje zavedení sekvenčních médií. Přes výše
naznačený problém hlavním hlediskem při selekci embryí pro zavedení
do dělohy zůstává stále jejich morfologie pro její snadné a rychlé
zhodnocení. I když se v literatuře objevují různé snahy o skórování
kvality blastocyst [4,19] a jsou známa určitá obecná kritéria, chybí
jednotný všeobecně přijímaný systém klasifikace jejich morfologie. My
jsme pro transfer volili 1 – 3 embrya s tendencí zavádět dvě velmi
kvalitní kompaktace nebo blastocysty. Bohužel některé pacientky neměly více
než jedno kvalitní embryo, u jiných žen embrya neměla požadovanou kvalitu
nebo pacientka absolvovala již několik neúspěšných cyklů – potom jsme
zaváděli embrya tři. Ztotožňuji se s názorem, že k transferu by
postačila jedna velmi kvalitní blastocysta [4], a to za předpokladu probíhajícího
spontánního hatchingu a dobré receptivity endometria. V naší laboratoři
jsme se však jen zřídka setkávali s počátečním hatchingem v den
5 kultivace / zatímco v in – vivo podmínkách zona pellucida mizí /,
kdy je nejvýhodnější transferovat pro nejlepší výsledky z ohledu
pregnancy rate. Domnívám se, že poté, co se v přirozeném cyklu dostává
embryo do dělohy, nastává ve srovnání s in – vitro podmínkami určitá
akcelerace vývoje. Je možné, že v blízké budoucnosti vyřeší tento
problém obohacení kultivačních médií o další složky podobné endometriálním
faktorům.
Zajímavým
problémem je získávání blastocyst v závislosti na věku. Letterie a
spol. popisují dosažení tohoto stadia při kultivaci embryí u 62 % pacientek
ve věku 36 – 42 let [22]. Marek a kol. uvádějí zvýšení pregnancy a
implantation rates při zavádění blastocyst ve srovnání s časnějšími
stadii vývoje embryí ve všech věkových kategoriích včetně žen nad 39
let [23]. S rostoucím věkem se nesnižuje počet získaných blastocyst,
ale klesá pregnancy rate /od 38 let věku/ a implantation rate /od 35 let/
oproti skupině mladších pacientek [24]. Problém rostoucího věku ženy
s sebou nese spíše riziko nižší reakce na ovariální stimulaci, nemá
však vliv na kvantitu vzniklých blastocyst. Signifikantně nižší pregnancy
a implantation rates jsou zapříčiněny chromozomálními abnormitami, které
nejsou neslučitelné se vznikem blastocysty, ale jsou v rozporu s dalším
embryonálním vývojem [4,19]. Některé z dřívějších prací naopak
popisovaly snížený vývoj blastocyst se zvyšujícím se věkem ženy [25]. V naší
studii jsme pro kultivaci do stadia blastocysty nevybírali pacientky podle věku,
ale pouze podle morfologického obrazu embryí v den 3 ráno. Ve skupině
žen 36 – 39 let dobře reagujících na stimulaci /alespoň 5 oocytů při
odběru/ jsme ve shodě s výše uvedenými nálezy bez problémů
dosahovali jak fáze kompaktace, tak blastocysty. Dokonce několik pacientek této
věkové kategorie s nízkou reakcí /2–4 oocyty při odběru/ reagovalo
vývojem stadia kompaktace nebo blastocysty.
Výsledky
naší práce demonstrují vysoký pregnancy rate u těch pacientek, kde jsme
transferovali alespoň jedno kompaktované
embryo nebo blastocystu. Zde je pregnancy rate téměř dvojnásobný oproti
souboru žen, kterým jsme zaváděli embrya pouze ve stadiu rýhování /graf
1/. Kvalitní embryo, které dosáhne kompaktace,
se pravděpodobně in - vivo bez problémů vyvíjí v blastocystu schopnou
implantace, neboť hodnoty pregnancy rate se ve skupinách s transferem
kompaktací a blastocyst v naší laboratoři od počátku téměř neliší.
Tento nález je ve shodě s literárními údaji [4]. Hodnoty, které vyplývají
z grafů 2, 3 a 4 mají spíše orientační význam, protože byly pořízeny
zatím z poměrně malých souborů pacientek. V den transferu se
embrya totiž nacházejí většinou v různých fázích vývoje, a tak ženám
zavádíme častěji jejich kombinaci. Postupem času se transfery „homogenního“
charakteru nahromadí a my získáme detailnější informaci. Literatura uvádí,
že zvýšení počtu blastocyst ze dvou na tři zásadně nezvyšuje pregnancy
rate [26,27]. V našem případě jsme jej prokázali dokonce
výrazně nižší. Domnívám se, že důvodem je dvojí fakt. Jednak
jsme k transferu tří blastocyst /ale i kompaktací/ přistupovali tam,
kde embrya nebyla špičkové kvality, jednak tam, kde jsme usuzovali na horší
receptivitu endometria, neboť pacientka absolvovala neúspěšně již více
cyklů, a to i s velmi kvalitním embryonálním faktorem. Ve shodě jsou i
výsledky grafů 3 a 4, kdy po transferu dvou embryí úspěšnost narostla, po
zavedení tří embryí zřejmě z výše uvedených příčin poklesla.
Transfer
embryí ve stadiu kompaktace a blastocysty se nám jeví jako optimální cesta
k dosažení klinické gravidity u pacientky bez ohledu na její věk. Při správně
volených selekčních kritériích můžeme kultivovat bez rizika snížení počtu
embryotransferů. Do budoucnosti je zapotřebí vypracovat podrobnější systém
hodnocení kvality blastocyst, který by posuzoval embryo nejen z morfologické
stránky. Tím by umožnil spolehlivěji predikovat jeho další vývoj v děloze.
1.
Handbook on blastocyst culture, Ariff Bongso, 1999, Singapore, Sydney
Press Indusprint, 93 s.
2.
Lessey, B.A.: The role of the endometrium during embryo implantation. Hum
Reprod, 15, Suppl. 6, 2000, s. 39-50.
3.
Marston, J.H. et al.: Successful autotransfer of tubal eggs in the rhesus
monkey /Macaca mulatta/. J Reprod
Fertil, 49, 1977, s. 175-176.
4.
Gardner, D.K., Lane, M. and Schoolcraft,
W.B.: Culture and transfer of viable blastocysts: a feasible proposition for
human IVF. Hum Reprod, 15, Suppl. 6, 2000, s. 9-23.
5.
Plachot, M. et al.: Blastocyst stage transfer: the real benefits compared
with early embryo transfer. Hum Reprod, 15, Suppl. 6, 2000, s. 24-30.
6.
Fanchin, R. et al.: Uterine contractions at the time of embryo transfer
alter pregnancy rates after in – vitro fertilization. Hum Reprod, 13, 1998, s.
1968-1974.
7.
Simón, C. et al.: Cytokines and embryo implantation. J Reprod Immunol,
39, 1998, s. 117-131.
8.
Lessey, B.A.: Endometrial integrins and the establishment of uterine
receptivity. Hum Reprod, 13, Suppl. 3, 1998, s. 247-258.
9.
Simón, C. et al.: Molecular interactions between embryo and uterus in
the adhesion phase of human implantation. Hum Reprod, 13, Suppl. 3, s. 219-232.
10.
Galán, A. et al.: Embryonic regulation of endometrial epithelial
apoptosis during human implantation. Hum Reprod, 15, Suppl. 6, 2000, s. 74-80.
11.
von Rango, V. et al.: The receptive endometrium is characterized by
apoptosis in the glands. Hum Reprod, 13, 1998, s. 3177-3189.
12.
Ley, U.B.: Relevance of endometrial pinopodes for human blastocyst
implantation. Hum Reprod, 15, Suppl. 6, 2000, s. 67-73.
13.
Smith, S.K.: Angiogenesis and implantation. Hum Reprod, 15, Suppl. 6,
2000, s. 59-66.
14.
Tesarik, J., Greco, E.: The probability of abnormal preimplantation
development can be predict by a single static observation on pronuclear stage
morphology. Hum Reprod, 14, 1999, s. 1318-1323.
15.
Tesarik, J. et al.: Embryos with high implantation potential after
intracytoplasmic sperm injection can be recognized by a simple, non – invasive
examination of pronuclear morphology. Hum Reprod, 15, 2000, s. 1396-1399.
16.
Chan, S. et al.: Blastocyst culture: Analysis of factors affecting the
development of embryos to the blastocyst stage. Fert Steril, 73, Suppl. 1, 2000,
s. 8S.
17.
Boostanfar, R. et al.: Blastocyst transfer is associated with an
increased rate of monozygotic twins. Fert Steril, 73, Suppl. 1, 2000, s.
10S-11S.
18.
Abaé, M., Firisin, W.K., Majercik, M.H.: A day 3 embryo index to help
predict blastocyst formation for day 5 embryo transfer. Fert Steril, 74, Suppl.
1, 2000, s. 97S-98S.
19.
Schoolcraft, W.B. et al.: Blastocyst culture and transfer: analysis of
results and parameters affecting outcome in two in vitro fertilization programs.
Fert Steril, 72, 1999, s. 604-609.
20.
Bavister, B.D.: Assessing blastocyst viability. Hum Reprod, 15, Abstract
book 1, 2000, s. 53.
21.
Graham, J. et al.: Day 3 morphology is a poor predictor of blastocyst
quality in extended culture. Fert Steril, 74, 2000, s. 495-497.
22.
Letterie, G.S., Marshall, L., Angle, M.: Does blastocyst transfer really
impact clinical outcome? Fert Steril, 73, Suppl. 1, 2000, s. 12S.
23.
Marek, D. et al.: Introduction of blastocyst culture and transfer for all
patients in an in vitro fertilization program. Fert Steril, 72, 1999, s.
1035-1040.
24.
Rodriquez, J.A. et al.: Does blastocyst transfer attenuate the expected
age – related decline in pregnancy and implantation rates? Fert Steril, 74,
No. 3S, 2000, s. 97S.
25.
Janny, L. and Ménézo, Y.J.:
Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst
formation. Mol Reprod Dev, 45, 1996, s. 31-37.
26.
Milki, A.A., Fish, J.D., Behr, B.: Two – blastocyst transfer has
similar pregnancy rates and a decreased multiple gestation rate compared with
three – blastocyst transfer. Fert Steril, 72, 1999, s. 225-228.
27.
Milki, A.A., Hinckley, M.D., Behr, B.: Three is a crowd with blastocyst
transfer. Fert Steril, 73, Suppl. 1, 2000, s. 15S.
PharmDr. Kristina Faltusová, IVF centrum Sanus, Labská kotlina 1220, 500 02 Hradec Králové
|
 |
 |
 |