Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: info@gyne.cz

POROVNANIE METÓD CLEARVIEW CHLAMYDIA MF A PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PRI DETEKCII CHLAMYDIA TRACHOMATIS U GYNEKOLOGICKÝCH PACIENTOK

Comparning of CLEARVIEW Chlamydia MF method to PCR in detection of C.trachomatis in materious from gynecology patients.

Šimončičová¹, M. Šimko², J.

¹ Lekárska fakulta UK, Sasinkova 4, 811 08 Bratislava, prednostka     

  Prof. MUDr. Daniela Kotulová, PhD.

² Centrum lekárskej genetiky, Špitálska 10, 811 08 Bratislava, primárka

  Doc. MUDr. Margita Lukáčová,CSc.

Súhrn

Autori prezentujú skúsenosti s detekciou Chlamydia trachomatis z endocervikálneho výteru metódou CLEARVIEW Chlamydia MF (OXOID). Citlivosť tohoto testu porovnávajú s metódou PCR .

Bližšie analyzovali súbor 75 pacientok s diagnózou tubárna sterilita, ženská neplodnosť, mimomaternicové tehotenstvo a predčasný pôrod.

Podľa výrobcu CLEARVIEW Chlamydia MF je rýchly, jednoduchý test pre priame stanovenie antigénu Chlamydia trachomatis z endocervikálnych sterov u žien a moča u mužov. Na základe získaných výsledkov autori však odporúčajú použitie testu ako orientačnú metódu hlavne pre ambulantnú gynekologickú prax.

Summary

The authors present their experience with Chlamydia trachomatis detection in endocervical swabs by the CLEARVIEW Chlamydia MF (OXOID). The sensitivity and specificity of the test is compared with those of PCR. Samples from 75 patients with diagnosis of tube sterility, infertility, extrauterine pregnancy and premature birth were examined.

CLEARVIEW Chlamydia MF is, according to the producer´s information, a rapid simple test for direct detection of Chlamydia trachomatis antigen in endocervical swab samples in females and from urine samples in males.

According to the results achieved in the study, the test can be recommended as an orientation method mainly for gynaecological practitioners of the first contact. In cases of unclear results, especially when samples with small amount of chlamydial antigen are analysed, the PCR technique seems to be more sensitive, as well as more specific.

Úvod

Chlamýdiové infekcie sú najčastejším sexuálne prenosným ochorením súčasnosti (11,12). Už krátkodobá  infekcia u žien spôsobuje  cervicitídu. Pri postupe patogénu  do  vyšších častí genitourinárneho traktu sa stávajú príčinou endometritídy, adnexitídy, ale aj peritonitídy, perihepatitídy a perisplenitídy. Sú príčinou viac, ako polovice zápalových ochorení v oblasti malej panvy, označovaných v gynekológii ako PID (Pelvic Inflammatory Disease).

K prvým príznakom ochorenia patrí  mukopurulentná  cervicítída  sprevádzaná  nahnedlým alebo nazelenalým výtokom, neskôr sa objavuje nepravidelné intermenštruačné krvácanie slabej  intenzity  ( spotting ).  V prípade  postihnutia  močových  ciest  je  klinický obraz obohatený o dysúriu. Diskrétna palpačná citlivosť v celom hypogastriu, neskôr  vytrvalé bolesti v podbrušku aj bez palpácie , sú častým sprievodným príznakom akútnej infekcie. Febrility sprevádzajúce ochorenie sú skôr výnimkou ako pravidlom. Veľká časť ochorení ale môže prebiehať asymptomaticky.  Bezpríznakový  priebeh  koreluje  s miernejšími  následkami dlhodobej infekcie, ku ktorým patrí obštrukcia vajcovodov a vznik rozsiahlych, často medziorgánových adhézií. Následom sú problémy s fertilitou,  zvýšený  výskyt extrauterínnych gravidít a tiež chronické bolesti v panvovej oblasti  (3,7,8,10 ).

     Cieľom predkladanej práce bolo porovnanie detekcie Ch.trachomatis medzi metódou PCR a nami  používanou  metódou CLEARVIEW  Chlamydia MF od firmy OXOID.

Metóda CLEARVIEW Chlamydia MF je rýchly, kvalitatívny test, ktorý umožňuje priamu detekciu povrchového lipopolysacharidového chlamýdiového antigénu z endocervikálneho výteru u žien alebo močového sedimentu u mužov. Zaručuje pomerne vysokú citlivosť, špecifickú reakciu a rýchlu detekciu (4,15).

Materiál a metódy

Metódou CLEARVIEW sme sledovali v období od 1.3.98 - 31.12.98 výskyt chlamýdií v gynekologických materiáloch, ktoré nám poskytla II. gynekologicko-pôrodnícka klinika na Šulekovej ul. v Bratislave.

Otestovali  sme  súbor 175 pacientok vo veku  18 - 30 rokov. Išlo hlavne o diagnózy ako tubárna sterilita, mimomaternicové tehotenstvo a predčasný pôrod.

Na  získanie  endocervikálneho  výteru sa použili odberové tampóny CLEARVIEW Chlamydia. Vzhľadom na to, že chlamýdie sú intracelulárne parazity, ktoré infikujú bunky cylindrického epitelu, zohrával veľmi dôležitú úlohu spôsob odberu materiálu. Pre odber vzorky sme použili dva tampóny.

Prvým bola odstránená z cervixu hlienová zátka.Samotný výter sme získali pomocou tampónu z odberovej súpravy rotáciou v cervixe počas 10 - 30 sekúnd  tak, aby sme získali cylindrické bunky epitelu. Je potrebné vyhnúť sa tomu,aby sa tampón počas odberu dotkol vaginálnej steny. Pre transport materiálu nie sú potrebné žiadne transportné médiá. Z materiálu je potom povrchový lipopolysacharidový antigén extrahovaný extrakčným činidlom, čím získame antigén s odobratých buniek. 

Extrakcia antigénu sa koná vo vodnom kúpeli pri 80^oC 10 minút. Ochladený  extrakt  sa potom priamo  nakvapká  z  extrakčnej  tuby  do  tzv.  vzorkového  okienka  CLEARVIEW, pozostávajúceho  z  poréznej  membrány.  Tá  obsahuje  na  latexové  častice naviazanú monoklonálnu protilátku proti chlamýdiovému antigénu (Obr.č.1).

Ak je chlamýdiový antigén vo vzorke prítomný, naviaže sa na zafarbenú latexovú časticu s monoklonálnou protilátkou. Potom komplex vzlína smerom k odčítaciemu okienku, kde sa nachádza ďalšia imobilizovaná monoklonálna protilátka proti chlamýdiovému antigénu.

Výsledkom imunologickej reakcie je vznik modrej línie v odčítacom okienku . Ak sa v extrakte chlamýdiový antigén nenachádza, línia sa samozrejme nevytvorí.

Posledné okienko slúži ako kontrola správnosti vykonania testu.V ňom by sa mala na základe prebehnutej imunologickej reakcie utvoriť modrá línia, ktorá indikuje správnosť vykonaného testu.

Princípom reakcie v tomto okienku,je naviazanie zvyšku voľných latexových častíc obalených myšími protilátkami na imobilizované králičie polyklonálne protilátky proti myším protilátkam.

Vzhľadom na to, že sa na spomínanom gynekologickom pracovisku testovala aj metóda PCR, pokúsili sme sa naše výsledky porovnať s výsledkami tejto vysoko citlivej metódy, ktorá sa pri diagnostike chlamýdií uplatňuje v stále rozsiahlejšom meradle ( 11).

Pre detekciu chlamýdií metódou PCR bol gynekologický materiál odoberaný kefkou Cyto-Brusch. Izolácia DNA bola robená klasickou fenol - chloroformovou metódou. Pelet bol rozpustený vo fyziologickom roztoku. PCR produkty sa analyzovali elektroforeticky v 1 % agarózovom géle a boli vizualizované ETBr pod UV svetlom (12).

Výsledky

Z celkového počtu 175 pacientok sme testom CLEARVIEW  Chlamydia MF (CW) zistili jasnú pozitivitu u 16 pacientok, čo je 9,14 % z testovaného počtu. Za suspektný výskyt sme považovali veľmi slabú modrú líniu, čo bolo u 15 pacientok, čo je 8,6 %.

V tomto prípade sme ošetrujúcemu lekárovi doporučili overenie pomocou PCR  ( tab.č.1).

Negatívnych výsledkov bolo 144 , čo je 82,29 % z celkového počtu 175-tich pacientok.

Z nášho celkového súboru 175 pacientok sa paralelne s metódou PCR vyšetrilo 75, kde bol materiál odobratý takmer paralelne , s rozdielom 1 - 3 dní. Len v 4 prípadoch bol materiál odobratý s rozdielom 1 - 3 týždňov. Výsledky boli nasledovné  ( tab.č.2 ) .

Rovnaký pozitívny výsledok u oboch metód bol u 6 pacientok, čo je 8,0 % z celkového sledovaného počtu. V 17 prípadoch PCR vyšlo pozitívne a CW negatívne, čo je 22,6 % , čo by sa dalo vysvetliť tým, že nebolo odobraté dostatočné množstvo antigénu potrebné pre dôkaz prítomnosti chlamýdií CW testom.

V prípade PCR však ide o vysoko citlivú metódu, kde na dôkaz chlamýdií stačí len fragment nukleovej kyseliny.V 5 prípadoch to bolo naopak, kedy PCR vyšlo negatívne a CW pozitívne čo je 11,1%.

Táto hodnota sa dá vysvetliť tým, že na CW  vyšetrenie bol poslaný materiál ešte pred započatím liečby a metódou PCR bol testovaný materiál už preliečených pacientok.

V 43 prípadoch boli zhodné negatívne výsledky, čo je 57,3 %.

V 1 prípade bol sporný výsledok u PCR, v 2 prípadoch u CW.

Diskusia

Pre potreby otestovania špecificity testu, sledoval výrobca možnosť reakcie testu s patogénnou aj nepatogénnou vaginálnou flórou.V suspenzii s koncentráciou 10⁵  - 10 ⁸ mikroorg. /ml nebola zaznamenaná žiadna falošne pozitívna reakcia (15).

Podľa jeho údajov test má nasledovné limitácie :

1. CLEARVIEW Chlamydia MF test sa dá použiť len na detekciu

antigénu  z  endocervikálneho  výteru u žien  alebo z močového                                                          

sedimentu  u mužov.

2. Test nie je schopný rozlíšiť akútne, chronické, prípadne latentné štádium ochorenia.

3. Pokiaľ je množstvo antigénu vo vzorke nižšie, ako je medza detekcie, test je negatívny.

4. Nesprávne odobratá vzorka, tj. ster bez  epitelových buniek,nesprávny výber odberového tampónu, tampón s veľkým množstvom hlienu, prípadne jeho nesprávne uskladnenie alebo transport, môže dávať falošne negatívny výsledok.

5. Pokiaľ sú výsledky testu negatívne alebo klinické príznaky pretrvávajú, odporúča sa   kultivácia alebo iná dostupnejšia metóda na detekciu chlamýdiového antigénu.

Z našich výsledkov a z vyššie uvedeného teda vyplýva, že rozdiely vo výsledkoch alebo sporné výsledky by sa dali vysvetliť :

- jednalo sa o kontrolné vyšetrenie po ukončení terapie

- materiál bol odobratý počas terapie alebo po preliečení infekcie

- materiál neobsahoval dostatočné množstvo antigénu (epitelových buniek) pre detekciu chlamýdií.

To by nám potom vysvetľovalo aj vysoký počet negatívnych výsledkov v súbore 175 pacientok testovaných metódou CLEARVIEW Chlamydia MF.

Záver.

Záverom možno teda len konštatovať, že veľkú úlohu zohráva nielen spôsob odberu materiálu, jeho transport, ale aj to, či sa jedná o materiál odobratý pred liečbou, počas nej alebo o kontrolný materiál už po ukončení liečby.

Citlivosť CLEARVIEW testu v porovnaní s metódou PCR sa ukázala byť nižšia, než udáva výrobca, ktorý však daný test porovnával s metódou dôkazu antigénu IF. Predpokladáme, že tu zohrával veľkú úlohu hlavne ľudský faktor, t.j. spôsob odberu materiálu, s čím súvisí aj množstvo antigénu vo vzorke, prípadne jeho nesprávny transport ( odstránenie nedostatkov, prípadne chýb pri odbere materiálu viď v popise odstavca "Materiál a  metodika").

Z tohoto dôvodu by sme CLEARVIEW Chlamydia MF test odporúčali v indikovaných prípadoch použiť skôr ako orientačné vyšetrenie pre gynekológa prvého kontaktu, ako pre použitie v mikrobiologickom laboratóriu, vzhľadom na jeho jednoduchosť a rýchlosť prevedenia.

Pre  špecializované   laboratóriá by sme odporúčali hlavne metódu PCR, ktorá umožňuje mnohonásobnú replikáciu / amplifikáciu špecifického úseku nukleovej kyseliny. Táto metóda má až 99 % špecificitu a vysokú senzitivitu. Umožňuje totiž zachytiť z odobratej vzorky prakticky jedinú,celistvú molekulu nukleovej kyseliny patogéna. Na základe zložitosti prevedenia je tento test vhohodný skôr pre špecializované pracoviská vyššieho typu.

Alternatívnymi metódami by mohli byť metódy na detekciu antigénu založené na princípe ELISA, I F alebo kultivácia patogéna. 

Literatúra

1. Dostál, J., Oborná, I.,Talaš, M., Chrastinová,L.,Machovská,K.:

    Infekční agens a léčba infertility metodou IVF + ET: 

    Čes.Gynek.61,1996,3,s.144-147.

2. Holop,P., Georeogh,J., Matuška,T., Mikovičová,A.: Podiel

    chlamýdiových infekcií na chronických gynekologických

    zápaloch. Praktic. Gynek. 2,1995, 3,s.143-149.

3. Kazár, J., Lokša, V., Osuský, P.: Chlamýdiové nákazy ľudí:   

    VEDA, 1992,I.vyd.,s.114.

4. Kolařík,J.: Genitální chlamýdiové nákazy v praxi - klinické 

    případy. Čs. Derm. 73,1998,No.5,p.164-167.

5. Kubo, R., Kaneko, T.,Nomura, A.,Kouda, M., Matsuzaki, H.,

   Murahashi,I.:Comparison of New Simple Immunochromatography

   Test and Conventional Assay for detecting Chlamydia in

    Urine.CICA KANTOReagents,Firemný materiál.

6. Mašata,J.,Řezáčová,J.,Sodja,I.: Léčba chlamydiové urogenitální  

    infekce.Čes.Gynek.63,1998,4,s.279-282.

7. Mašata,J., Řezáčová,J., Sodja,I., Drbohlav,P.: Chlamydia 

    trachomatis - epidemiologická situace. Čes. Gynek. 63, 1998, 3,

    s.217-220.

8. Orfila,J.: Chlamydia Testing for Specialists.1992 The F DGroup  

    Ltd.

9. Ostró,A., Pačin,J., Gondoľ,J., Čisláková,L., Toncr,J.: 

    Chlamýdiové  infekcie u hospitalizovaných žien s rôznymi

    formami patologickej gravidity.Prakt.Gynekol.2,1995,3,

    s.140-142.

10. Pilka,L.:Chlamydiová infekce v gynekologické praxi. 

      Gynekolog, 1997, 6, 1,s.9.

11.Šimko,J.,Regendová,M.,Kazar,J.,Kováčová,L.,Poláková,L.,

     Križko,M.,Holomáň,K.: Naše prvé skúsenosti s diagnostikou   

   chlamýdií pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) u 

     gynekologických pacientok. Slov. Gynekol. a Pôrodn. 5, 1998,

     s.55-58.

12. Šimko,J.,Štencl,P.,Križko,M.,Holomáň,K.,Černický,T.: 

      Polymerázová reťazová reakcia a jej využitie v gynekológii a 

      pôrodníctve.Slov.Gynek.a Pôrod.,3,1996,s.23-26.

13.Šulová,A.,Strmisková,J.,Pilka,L.,Věžník,Z.,Pospíšil,L.: Přímý a

    nepřimý prukaz chlamydií u neplodných manželských páru 

    zařazených do programu asistované reprodukce. Čes. Gynekol.  

    62,1997,3,s.134-137.

14.Ville,Z.,Carroll,s.g.,Watts,P.,Ward,M.,Nicolaides,K.H.: 

    Chlamydia trachomatis infection in prelabour amniorrhexis.British 

    J. Obstet. Gynaecol.,1997,104,1091-1093.

15.Woolley,P.: A Step Forward for Chlamydia Diagnosis in

    Genitourinary Medicine.The F D Group Ltd.,1992. Firemný 

    materiál.

16.Yang,Ch.,Zhu,D.Y.: Glycogen Assay for Diagnosis of Female 

    Genital Chlamydia trachomatis Infection.J.of Clin. Microbiol.,

    1998, 36, 4,1081-1082.

17.CLEARVIEW Chlamydia MF od firmy Unipath OXOID. Firemný

    materiál

    Obr.č.1

Tab.č.1

Výskyt chlamýdiového antigénu v sledovanom súbore 175 pacientok metódou CLEARVIEW Chlamydia MF(CW).

Tab.č.2

Porovnanie výskytu chlamýdiového antigénu u súboru 75 pacientok metódou PCR a CLEARVIEW Chalmydia MF.