Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: info@gyne.cz

KONCENTRACE KADMIA VE FOLIKULÁRNÍ TEKUTINĚ A SEMINÁLNÍ PLASMĚ U NEPLODNÝCH DVOJIC PŘI  IN  VITRO  FERTILIZACI

The cadmium concentration in the follicular fluid and seminal plasma of infertile couples treated by in vitro fertilisation

¹Crha, I., ²Rézl, P., ²Hrubá, D., ¹Ventruba, P., ²Fiala, J., ¹ Žáková, J., ¹Paseka, J.

¹I. gynek. - porod. klinika LF MU, Brno, přednosta prof. MUDr. P. Ventruba, DrSc.

²Ústav preventivního lékařství LF MU, Brno, přednosta doc. MUDr. D. Hrubá, CSc.

Úvod

Rostoucí počet pacientů  postižených neplodností vede k intenzivnímu zájmu o problematiku toxického poškození gamet. Kadmium (Cd) je často považováno za jednu z látek, které se mohou na zhoršení lidské plodnosti podílet. Tento kov je pro člověka toxický, je v životním prostředí poměrně rozšířen a v průběhu života se v lidském organismu akumuluje. Bylo prokázáno, že kadmium poškozuje cévní  endotel s následnou obstrukcí mikrocirkulace a nekrózou v mnoha orgánech včetně vaječníků, varlat a placenty.

Cílem této  studie bylo detekovat kadmium ve folikulární tekutině (FT) a seminální plasmě (SP) u neplodných párů při in vitro fertilizaci (IVF). Studie analyzovala: 1./ koncentraci Cd ve FT po ovariální stimulaci v průběhu IVF cyklu, 2./  rozdíly v koncentraci Cd mezi jednotlivými folikuly, 3./ koncentraci Cd ve folikulech s oocytem a bez oocytu a 4./ koncentraci Cd v seminální plasmě mužů s normálním nebo patologickým spermiogramem.

Materiál a metody

Soubor tvoří 45 neplodných párů zařazených do programu asistované reprodukce I. gynek. - porod. kliniky v Brně. Folikulární vývoj byl stimulován gonadotropiny (hMG, FSH) v dávce 150 - 225 IU/den v kombinaci  s GnRH analogy v krátkém (buserelin) nebo dlouhém protokolu (triptorelin). Stimulovaný cyklus byl monitorován stanovením 17-betaestradiolu, LH, progesteronu a ultrazvukové folikulometrie. Po dosažení adekvátní ovariální odpovědi byla maturace oocytů indukována aplikací 5000-10000 IU lidského choriového gonadotropinu. Za 34 - 36 hodin po této injekci byl proveden transvaginální odběr oocytů pod kontrolou UZ (Ventruba et al., 1997). Byla vyšetřována pouze FT bez kontaminace krví. Seminální plasma byla separována centrifugací při přípravě spermií. Hodnocení spermiogramu bylo prováděno standardním způsobem dle zásad WHO.

Detekce kadmia: Pro přípravu vzorku byla použita metoda mikrovlnného rozkladu (Milestone mls 1200).  K 2 ml folikulární tekutiny byl přidán 1 ml koncentrované HNO3 (Suprapur, Merck) a 2 ml H2O2 (30% puriss.p.a., Fluka). Po přípravě vzorku byly  hladiny Cd ve folikulární tekutině měřeny na principu atomové absorbční spektrometrie na grafitové kyvetě (Crha et al). Byl  použit system Unicam Solar 939. Vzorky byly aplikovány s modifikátorem matrix 2% NH4h2PO4  a atomizovány při teplotě 1400° C.

Výsledky

Od 45 žen bylo získáno celkem  249 vzorků  folikulární  tekutiny, které nebyly kontaminovány krví. Počet vzorků od jedné pacientky byl v rozmezí 2 - 12 folikulů, s průměrem 5,5 ± 2,1. Koncentrace Cd ve folikulární tekutině byly v rozmezí  0,1 - 1,3 ng/ml, průměr 0,13 ± 0,16 ng/ml.  75,9 % folikulů mělo koncentraci Cd £ 0,1 ng/ml a jen 2 % folikulů mělo koncentraci  ³ 0,8 ng/ml (tab. 1). Byly prokázány signifikantní rozdíly v koncentraci kadmia mezi jednotlivými folikuly  u  stejné pacientky.

Z celkového počtu 249 vyšetřovaných folikulů bylo získáno 97 oocytů, 152 folikulů bylo prázdných. Průměrná hodnota Cd ve folikulech se získaným oocytem byla 0,12 ± 0,13 ng/ml, v prázdných folikulech  0,14 ± 0,14 ng/ml. Tento rozdíl nebyl statisticky  signifikantní. Při pohledu na tabulku č. 2 je však patrno, že 94,8 % oocytů bylo  získáno z folikulů s Cd koncentrací  £ 0,1 ng/ml a z folikulů s Cd koncentrací > 0,3 ng/ml nebyl získán žádný oocyt (tab. 2).

Koncentrace Cd v seminální plasmě byly v rozmezí 0,1 - 9,0 ng/ml. V pásmu do 0,2 ng/ml bylo celkem 31 mužů (68,9 %), v pásmu do 1,0 ng/ml bylo 44 mužů (97,8 %). Průměrná hodnota byla 0,46 ± 1,5 ng/ml. Koncentraci  spermií > 20 mil/ml mělo 29 mužů (64,4 %), koncentraci < 20 mil/ml mělo 16 mužů  (35,6 %). Progresivní pohyb spermií 
> 50 % mělo 11 mužů (24,4 %), progresivní pohyb < 50 %  mělo 34 mužů (75,6 %). Korelační analýza dle Pearsona  neprokázala žádnou souvislost mezi koncentrací Cd v seminální plasmě a koncentrací  nebo motilitou spermií (obr. 1, 2).

Diskuse

V experimentálních studiích na laboratorních zvířatech jsou reprodukční orgány výrazně citlivé na toxické účinky kadmia (Cooper, 1979, Pisa et al., 1990, Friberg et al. 1992).  O koncentraci  kadmia v lidském ovariu je však jen velmi málo informací. Při porovnání dostupných údajů jsou patrny výrazné rozdíly.  Zenses et al. (1995) v Torontu detekovala ve folikulární tekutině koncentrace Cd 6,73 ± 0,31 ng ml u nekuřáků a 7,93 ± 0,16 ng/ml u kuřáků. V této studii byla vyšetřována tekutina pouze z jednoho folikulu, pro přípravu vzorku byla použita méně citlivá metoda precipitace a odstranění proteinu. Maier et al. (1995) v Heidelbergu prokázali ve folikulární tekutině koncentrace Cd 2,0 ng/ml. V naší studii byla průměrná koncentrace Cd 0,13 ± 0,16 ng/ml. Co je příčinou těchto rozdílů? Pečlivě jsme testovali a prokázali spolehlivost metody analýzy Cd  včetně přípravy vzorku mikrovlnným rozkladem, který se prokázal jako citlivější než odstranění   proteinu precipitací. Porovnali jsme také údaje o koncentraci Cd v krvi. Shaham et al. (1996) v Tel Avivu prokázala koncentraci Cd  0,85 ng/ml u nekuřáků a 0,97 ng/ml u kuřáků. Telišman et al. (1997) v Záhřebu uvádí koncentraci Cd u nekuřáků 0,46 ng/ml a 4,33 ng/ml u kuřáků. V rámci naší studie jsme také vyšetřovali koncentraci Cd v krvi v souvislosti s kouřením. U nekuřáků byly hladiny Cd  0,31 ng/ml a u kuřáků 0,58 ng/ml. Domníváme se, že rozdílné hladiny Cd mohou být vysvětleny různou expozicí kadmiu. V České republice je expozice kadmiu velmi nízká včetně půdy a kontaminace potravy. Na této nízké kontaminaci se výrazně podílí používání hnojiv, především superfosfátů s nízkým obsahem kadmia, v minulých desetiletích. Naopak např. v Kanadě je kontaminace půdy kadmiem vysoká.

Dalším zdrojem kadmia je kouření. Zplodiny cigaretového kouře (např. cotinin, kadmium, benzo-pyren) byly detekovány i ve folikulární tekutině (Zenzes 1996, Weiss 1989). Byl prokázán  nepříznivý vliv kouření na výsledky in vitro fertilizace  (Howe, , Elenbogen et al. 1991, Rosevear et al. 1992) a vývoj těhotenství (Pattison, Hughes et al. 1994). V našem souboru bylo 62 % nekuřáků. Při analýze jsme zjistili signifikantně vyšší hladiny Cd v krvi u kuřáků (0,58 ng/ml) proti nekuřákům (0,31 ng/ml). Souvislost s koncentrací Cd ve folikulární tekutině jsme však nezjistili.

V dostupné literatuře jsme nenašli žádné údaje o rozdílech v koncentraci Cd v jednotlivých folikulech. Důkladně jsme analyzovali a vyloučili kontaminaci vzorku kadmiem při odběru folikulární tekutiny. Byly  také vyšetřovány pouze vzorky  bez kontaminace krví, protože erytrocyty mohou být zdrojem kadmia. Tyto výsledky svědčí pro nerovnoměrné ukládání kadmia v ovariální tkáni.

Klinických studií o vlivu kadmia na reprodukční funkce muže je velmi málo a přináší rozporné výsledky. Korelaci mezi hladinami Cd v krvi či seminální plasmě a zhoršením koncentrace a motility spermií prokazují Chia et al. (1993) a Xu et al. (1993). Naopak Keck et al. (1995) a Gennart et al. (1992) vliv kadmia na parametry spermiogramu neprokázali, což odpovídá výsledkům naší studie.

Průměrná koncentrace Cd v seminální plasmě 0,46 ng/ml v našem souboru je srovnatelná s hodnotou 0,54 ng/ml, kterou udává Telišmanová et al. (1997). Zajímavá je vysoká koncentrace Cd 9,0 ng/ml v jednom případě. Tento vzorek byl opakovaně vyšetřován a stejná hodnota potvrzena. Tato vysoká hladina Cd však nebyla spojena s patologickými hodnotami spermiogramu  - koncentrace 55 mil/ml a progresivní pohyb 60% byly v pásmu normy. Zvýšená exposice kadmiu u tohoto muže nebyla prokázána a příčinu této vysoké koncentrace kadmia se nám nepodařilo objasnit.

Závěr

Byly prokázány signifikantní rozdíly v koncentraci kadmia mezi jednotlivými folikuly stejného ovaria bez vlivu na zisk oocytu. Koncentrace kadmia v seminální plasmě u mužů s normálním a patologickým spermiogramem se signifikantně nelišily. Výrazný podíl kadmia na lidské neplodnosti nebyl prokázán..

Literatura

1.   Cooper, P.: Cadmium and the testis. Food Cosmetic Toxicol, 17, 1979, s. 544 - 546.

2.   Crha, I., Rézl, P.,  Hrubá, D., Ventruba, P., Totušek, J.: Cadmium Residues in the Follicular  Fluid of Infertile Women. Scripta medica, 1998, v tisku.

3.   Elenbogen, A., Lipitz, S., Mashiach, S.: The effect of  smoking on the outcome of in vitro fertilization-embryo  transfer. Hum. Reprod., 6, 1991, s. 242 - 244.

4.   Friberg, L., Elinder, C.G.: Cadmium. WHO Environmental Health  Criteria, Geneva, 134, 1993, s. 254.

5.   Gennart, J.P., Buchet, J.P., Roels, H., Ghyselen, P., Ceulemans, E., Lauwerys, R.: Fertility of male workers exposed to cadmium, lead, or manganese. Am. J. Epidemiol., 135, 1992, s. 1208 - 1219.

6.   Howe, G., Westhoff, C., Vessey, M.: Effects of age,  cigarette smoking and other factors on fertility: findings in  a large prospective study. Br. Med. J., 290, 1985, p. 1697 - 1700.

7.   Hughes, E.G., Yeo, J., Claman, P.: Cigarette smoking and  the outcomes of in vitro ferti-lization: measurement of effect  size and levels of action. Fertil. Steril., 62, 1994, p. 807 -  814.

8.   Chia, S.E., Ong, C.N., Lee, S.T., Tsakok, F.M.H.: Blood concentrations of lead, cadmium, mercury, zinc, and copper and human semen parameters. Arch. Androl., 29, 1992, s. 177 - 183.

9.   Keck, C., Bramkamp, G., Behre, H.M., Muller, C., Jockenhovel, F., Nieschlad, E.: Lack of correlation between cadmium in seminal plasma and fertility status of nonexposed individuals and two cadmiumexposed patients. Reprod. Toxicol., 9, 1995, s. 35 - 40.

10.Maier, K.H., Roller, E., Vaallon, U., Clédon, P.: Heavy metal analysis of follicular fluid from patients undergoing IVF.  Hum. Reprod., 10, 1995, Abstract Book,  s.135.

11.Pattison, H.A., Taylor, P.K., Pattison, M.H.: The effect of  cigarette smoking on ovarian function and early pregnancy  outcome of in vitro fertilization treatment. Fertil. Steril., 55, 1991, s. 780 - 783.

12.Pisa, J., Cibulka, J., Ptacek, M.: Effect of subcutaneous application of a single cadmium dose on oocyte maturation in vitro. Physiol. Bohemoslov., 39, 1990, s. 185 -190.

13.Rosevear, S.K.,Holt, C.W.,Lee, T.D.: Smoking and decreased  fertilization rates in vitro. Lancet, 340, 1992, s. 1195-1196.

14.Shaham, J. Meltzer, M., Ashkenazi, R., Ribak, J.: Biological Monitoring of Exposure to Cadmium, a Human Carcinogen, as a Result of Active and Passive Smoking. J. Occup. Environ. Med., 38, 1996, s. 1210 - 1215.

15.Telišman, S., Jurasovič, J., Pizent, A., Cvitkovič, P.: Cadmium in the blood and seminal fluid of nonoccupationally exposed adult male subjects with regard to smoking habits.  Int. Arch. Occup. Environ. Health, 70, 1997, s. 243 - 248.

16.Ventruba, P., Žáková, J., Crha, I., Němcová, S.: Intracytoplasmatická injekce spermie do oocytu a asitovaný hatching - mikromanipulační techniky zvyšující úspěšnost programu fertilizace in vitro. Prakt. Gynek., 1, 1997, s. 14 - 25.

17.Weiss, T., Eckert, A.: Cotinine levels in follicular fluid and  serum of IVF patients: effect on granulosa-luteal cell  function in vitro. Hum. Reprod., 4, 1989, p. 482 - 485.

18.Xu, B., Chia, S.E., Tsakok, M., Ong, C.N.: Trace elements in blood and seminal plasma and their relationship to sperm quality. Reprod. Toxicol, 7, 1993, s. 613 - 618.

19.Zenzes, M.T., Krishnan, S., Krishnan, B., Zhang, H., Casper, R.F.:  Cadmium accumulation in follicular fluid of women in in vitro  fertilization - embryo transfer is higher in smokers. Fertil.  Steril., 64, 1995, s. 599 - 603.

20.Zenzes, M.T., Reed, T.E., Wang, P., Klein, J.: Cotinine, a major  metabolite of nicotine, is detectable in follicular fluids of  passive smokers in in vitro fertilization therapy. Fertil.  Steril., 66, 1996, s. 614 - 619.

Podporováno grantem IGA MZ ČR č. 4078 - 3.

Koncentrace kadmia ve folikulární tekutině a seminální plasmě
u neplodných dvojic při  in  vitro  fertilizaci.

¹Crha, I., ²Rézl, P., ²Hrubá, D., ¹Ventruba, P., ²Fiala, J., ¹ Žáková, J., ¹Paseka, J.

¹I. gynek. - porod. klinika LF MU, Brno, přednosta prof. MUDr. P. Ventruba, DrSc.

²Ústav preventivního lékařství LF MU, Brno, přednosta doc. MUDr. D. Hrubá, CSc.

Obr. 1: Vztah mezi koncentrací kadmia v seminální plasmě a koncentrací spermií (n=45).

Obr. 2: Vztah mezi koncentrací kadmia v seminální plasmě a motilitou spermií (n=45).