Časopis ženských lékařů  G Y N E K O L O G - www.gyne.cz - email: info@gyne.cz

HISTORIE VÝZKUMU LIDSKÉHO PAPILLOMAVIRU V SOUVISLOSTI S KARCINOMEM DĚLOŽNÍHO ČÍPKU

History of the human papiloma virus research in connection with cervical carcinoma

 

 

O. Nyklíček

Centrum gynekologické cytodiagnostiky, Náchod

Pro vysvětlení úlohy lidských papillomavirů (HPV) v souvislosti se zhoubným bujením na děložním čípku lze uvést onkogenovou teorii vzniku nádorů, v současnosti nejčastěji přijímanou. K tomuto konstatování mohlo dojít jen díky pokrokům technik molekulární biologie. Jen ve skutečnosti se zmiňme o genech, které jsou odpovědné za nádorovou přeměnu buňky. Od konce sedmdesátých let jsou tyto činitelé nazývány onkogeny. Jsou to však geny, které sehrávají důležitou úlohu především ve fyziologické činnosti, při regulaci růstu a profilaci buněk. Tytéž geny - v tomto případě nazývané protoonkogeny - mohou však působit při transformaci normálních buněk v nádorové jen tehdy, když dojde k jejich strukturálním změnám nebo ke kvantitativním poruchám v jejich expresi. K této tzv. aktivaci onkogenů dochází nejčastěji mutacemi, často bodovými, dále translokacemi, amplifikací nebo ztrátami určitých úseků genu. Opačnou roli než onkogeny sehrávají tzv. onkosupresorové geny - nazývané rovněž antionkogeny, které jsou odpovědné za inhibici dělení buněk, jejich diferenciaci a stárnutí. Různá poškození nádorových supresorových genů např. opět mutacemi, vedou k inaktivaci jejich produktů a tím ke ztrátě antiproliferativní kontroly buněk. Lze tedy shrnout, že aktivací onkogenů a inaktivací onkosupresorových genů se vytvářejí podmínky pro neregulovatelný růst nádorových buněk. Zásadní pokrok ve výzkumu maligní transformace buněk se uskutečnil hlavně v oblasti virologie. Podobně jako buněčné onkogeny, některé viry - též zvané transformující obsahují aberantní formy protoonkogenů, které uskutečňují nádorovou přeměnu buněk v napadnutém hostiteli. Tato schopnost se týká jak RNA tak DNA virů. Prvním milníkem při transformační úloze papovavirů se stala v roce 1933 Shopeho práce o infekční papillomatóze králiků a rok poté publikace Rouse a Bearda o viry indukovaných karcinomatózních změnách těchto papilómů. Nastává pak údobí experimentálních důkazů papillomavirové infekce a jejich následků, zvláště poté, když 1949 Strauss a spol. elektronopticky prokázali virální partikule v lidských bradavicích. V roce 1961 Ito a Evans zjistili, že genom papillomaviru může působit jako samostatný karcinogen a roku 1963 Crawford a spol. objasnili fyzikální vlastnosti papillomavirové DNA. Původní Shoppeho papilomavirus byl pojmenován jako Cottontail rabbit papillomavirus (CRPV). Významnou úlohu v této problematice sehrál výzkum bovinního papillomaviru (BPV). Od roku 1951 se ví, že infekce tímto virem není species - specifická (Olson, Cook), a že je přenosná na koně, kde vytváří sarkoidózu, a že je příčinou nádorů močového měchýře u křečků a myší (1,9).

Po potvrzení heterogenity BPV, byly první typy objeveny v roce 1978 (15) a roku 1980 se zjistilo, že k transformaci stačí jen část virálního genomu. Roku 1982 byl kompletně sekvenován BPV 1 typ (4). Největším vkladem při výzkumu lidských papillomavirů přispěla skupina badatelů Heidelbergské univerzity v čele s prof. zur Hausenem. Byl to on, který roku 1973 přednesl na shromáždění Americké asociace pro výzkum rakoviny hypotézu, že karcinom děložního čípku může být způsoben papillomavirem. Tato práce byla publikována teprve v roce 1976 v Cancer Research pod názvem Condylomata accuminata and human genital cancer. Cesta k tomuto konstatování byla otevřena dvěma na sebe navazujícícmi články, uveřejněnými v roce 1974 heidelbergskými výzkumníky s názvy : Attemps to detect virus - specific DNA sequences in human tumors. Technikami restrikčních endonukleáz byla v roce 1976 prokázána existence heterogenetiky i u HPV a následná indentifikace jejich genotypů. Když se pak potvrdilo, že virus cRNA z plantárních bradavic nehybridizuje s DNA genitálních kondylomat a s bioptickými vzorky z karcinomu čípku, předpověděli existenci dosud neznámých HPV typů. Jako první byl izolován HPV 6 právě z genitálních kondylomat v roce 1980 Gissmanem a spol. Klonování a charakterizace tohoto typu (6) se staly popudem pro další, rychle se rozšiřující izolace jako HPV 11 (10, 11) a poté dalších, v anogenitální krajině velmi důležitých a později označovaných "rizikových" HPV typů 16 a 18 (2, 7). Potvrzením správné cesty výzkumu byl nález těchto typů i v prekancerózních lezích z děložních čípků a nakonec i v biopsiích těchto tkání. Genomy HPV se pak objevili a indentifikovaly i v buněčných liniích z CA cervicis (rovněž ve známé linii Hela buněk) 2). Dalším milníkem výzkumu se stal průkaz, kdy specifické geny E6 a E7 virálních typů nalezených v karcinomu čípku jsou pravidelně transkribovány v Ca buňkách (26) a že v buněčných tumorózních liniích a v bioptických vzorcích se našla integrována virální DNA. Potvrdila to identifikace specifického přepisu genů E6/E7 v Ca cervicis, dále integrace virové DNA do DNA hostitele a přerušení čtecího rámce virové E2 DNA. Dále bylo důležité ověřit zda exprese virálního onkogenu je směrována jen pro proliferati- změny nebo rovněž pro udržení malignity. Po průkazu, že HPV 16 indikuje maligní transformaci buněk NIH 3T3 (31) byla zjištěna, po transfekci typem HPV 16 DNA, nesmrtelnost lidských keratinocytů a fibrolastů (7, 23). Následně se pak potvrdilo, že jedině geny E6 a E7 jsou potřebné k imortizaci (18) a že ji způsobují jen za určitých podmínek. Potvrdilo se dále, že je nezbytná exprese aspoň jednoho z virových onkogenů pro profileraci a malignitu. To bylo prokázáno uměle vytvořeným úsekem DNA, který byl doplňkem ke genu E6/E7. Všechny tyto skutečnosti potvrdily existenci mechanismu intracelulární kontroly, která je činná na úrovni virálních onkoproteinů. Na tom spočívá další zur Hausenova hypotéza z roku 1994, vycházející ze tří předpokladů: za prvé je nutná infekce buňky a inkorporace HPV do buněčného genomu. Za druhé jsou potřebné změny dvou alelových párů, tedy 4 genů v hostitelské buňce. Každý pár je odpovědný za kontrolu na nitrobuněčné úrovni a sice první pár za posttranskripační kontrolu (při manipulaci dojde k přerušení nitrobuněčné kontroly a nesmrtelnosti buněk in vitro). Druhý pár je pak odpovědný za transkripační kontrolu (při mutaci dojde k přerušení mezibuněčné kontroly produkty aktivovaných makrofágů a následnému vzniku vysoce rizikových lezí). Za třetí se zdůrazňuje, že nerozpoznání buňky imunitním systémem je způsobeno buď nemožností předložit antigeny virových bílkovin buňkám T, anebo nepřítomností MHC bílkovin, které toto předkládání vykonávají. Důraz se klade na změny oněch dvou alelových párů v hostitelské buňce, které rovněž vysvětlují malou frekvenci nádorových buněk mezi infikovanými jedinci a dlouhou dobu latence. Další důležitý objev publikovali v roce 1989 Dyson a spol., kdy zjistili, že vysoce rizikový onkoprotein E7 váže buněčný RB protein. Brzo poté Wernes a spol. 1990 a Scheffner a spol. 1990 prokázali, že vysoce rizikový onkoprotein E6 váže i buněčný protein p53, což vede k jeho rychlé degradaci. K této problematice zur Hausen poznamenává, že indukce chromozomální nestability se zdá být předpokladem pro mutace ve specifické signální cestě a nabízí vysvětlení pro vysoce rizikové HPV viry, působící jako samostatné karcinogeny. Naopak nízko rizikové viry buď neváží p53 anebo tak činí jen v malé míře. Zdá se tady, že nízko rizikové typy virů HPV požadují další zevní faktory -mutageny-, aby mohlo dojít k indukci maligního růstu. Když pak Han se spol. roku 1992 upozornili na úlohu genetických determinant při regresi a progresi CRPV indukovaných papilomů, stal se CRPV systém vhodným pro studium vakcinací a výhledově pro možnou prevenci (3, 16).

Klinické uplatnění

V roce 1976 Meisels a Fortin popsali v cytologických nátěrech z děložních čípků tzv. koilocyty, charakteristické buňky, jejichž morfologie je utvářena cytopatickým efektem HPV. Stojí zato poznamenat, že takové charakteristické alterace buněk zaznamenal již v roce 1933 Papanicolaou, ovšem aniž by je blíže specifikoval. Jako první roku 1956 Koss a Durfee pojmenovali tyto projevy jako koilocytotické atypie. Od okamžiku, kdy bylo vysloveno podezření na možnou infekci cervixu papillomavirem v souvislosti s jeho preinvazivními změnami (1973), nastala doslova exploze publikací, kterých je do dnešního dne nespočet. Svědčí to pro jeden z nejzávažnějších objevů, který posloužil k rychlému poklesu výskytu karcinomu čípku. Cytopatický efekt infekce HPV se relativně snadno prokazuje prebioptickými metodami, hlavně cytologií, méně již některými kolposkopickými obrazy, pak i histologií a elektronovou mikroskopií. Infekce HPV je sexuálně přenosné onemocnění s inkubační dobou 6 až 8 týdnů. Cílem infekce u muže je penis. HPV infekce na čípku se projevuje jako kondylomatózní nebo plochá epiteliální léze či invertovaná forma. Je shoda v názorech, že virus vstupuje do buňky cytoplasmatickou membránou a napadá jak cytoplasmu, tak jádro hostitelské buňky. V jádře se virus může vyskytovat samostatně nebo integrovaně s jadernou DNA hostitele v podobě dysplastických a atypických změn. Typický koilocyt byl i v naší literatuře mnohokrát popsán právě tak, jako dyskeratocyt (Nyklíček a spol. 1985, 1986). Progresivní potenciál rizikových typů byl prokázán Syrjänenem ve velké prospektivní studii v roce 1981. Výsledky a rozvahy této práce zaznamenal do výstižného diagramu, kde upozorňuje na dva důležité úseky infekce HPV a sice na tzv. klinickou a subklinickou infekci, (Nyklíček, 1993). Elektronopticky se intranukleárně umístěné virální partikule obtížně hledají v keratinizovaných buňkách v naší sestavě jen v 15% prokázaných HPV infekcích (19). V současně užívaném Bethesda systému pro hodnocení cervikovaginálních diagnóz je zahrnuta integrace HPV infekce s intraepiteálními lézemi nízkého i vysokého stupně a týká se zde hlavně rizikovostí jednotlivých typů HPV DNA. Signifikantně vyšší podíl LSIL je sdružen s výskytem nízkorizikových typů - převážně 6 a 11 - s pravděpodobností menší možností progrese, oproti souběžností vysoce rizikových typů - hlavně 16 a 18, kdy s velkou pravděpodobností dojde k progresi do vyšších stupňů - HSIL. V současném období je u nás zatím neúnosné rutinně vyhledávat jednotlivé typy HPV a vybírat mezi nimi zvláště ony rizikové, i když jsou k dispozici již příslušné testy, které jsou však stále ještě limitované sensitivity. Mělo by být proto cílem zdokonalení techniky a cenové dostupnosti vyšetřovacích metodik. V poslední práci z roku 1996 zur Hausen, poznamenává, že vývoj - serologických metod pro detekci HPV, založených na syntéze virus-like partikulí v rekombinantních systémech a zvláště pak jejich využití jako vakcin pro prevenci HPV infekcí, se zdá být velmi nadějný. Dnes tedy, po 13ti letech po identifikaci vysoce rizikových virů v karcinomu čípku, se zdá být vysvětlena příčinná role specifického infekčního činitele. Závěrem zur Hausen konstatuje, že je možné proto prohlásit, že premaligní intraepiteliální neoplasie jsou papillomavirové etiologie.

Literatutra

1. Boiron, M et al. : Some properties of bovine papilloma virus. Nature, 201, 1964, s. 423 - 424. 2. Boshart, M. et al. : A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer and in cell lines derived from genital cancer. EMBO J. 3, 1984, s. 1151 - 1157. 3. Breitburd, F. : Immunization with virus - like particles from cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) can protect against experimental (CRPV) infection. J. Virol., 69, 1995, s. 3959 - 3963. 4. Chen, E. et al. : The primary structure and genetic organization of the bovine papillomavirus (BVP) type 1 genome. Nature 299, 1982, s. 529 - 534. 5. Crawford, E. et al. : A comparative study of polyoma and papilloma viruses. Virology, 21, 1963, s. 258 - 263. 6. de Villiers, E. et al. Molecular cloning of viral DNA human genita 1 warts. J. Virol., 40, 1981. 7. Dürst, M. et all : A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and ist prevalence in cancer biopsy samples from differentgeographic regions. Proc. Nat. Acad. Sci., 80, 1983, s. 3812 - 3815. 8. Dyson, N. et all The human papillomavirus 16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product. Science 243, 1989, s. 934 - 937. 9. Friedmann, J. et al. Induction de fibromes sous - cutanés chez le hamster doré par inoculation d extrait acellularies de papillomes bovins et leur transformation maligne par greffes isologues. C. R. Acad. Sci, 257, 1963, s. 2328 -2331. 10. Gissman, L. et al. : Partial characterization of viral DNA from human genital warts. Int. J. Cancer 25, 1980, s. 605 - 609. 11. Gissman, L. et al. : Molecular cloning and characterization of human papillomavirus DNA from a laryngeal papilloma. J. Virol. 44, 1982, s. 393 - 400. 12. Han, R. et al. : Linkage of regression and malignant conversion of rabbit viral papillomas to MHC class II genes. Nature 356, 1992, s. 66 - 68. 13. Ito, Y. et al. : Induction of tumors in domestic rabbits with nucleic aacid preparations from partially purified Shope papillomavirus and from extracts of the papilomas of domestic and cottontail rabbits. J. Exp. Med. 114, 1961, s. 485 - 491. 14. Koss, L. et al. : Unusual patterns of squamous epithelium of the uterine cervix : cytologic and pathologic study of koilocytotic atypia. Ann. NY. Acad. Sci. 63, 1956, s. 1245 - 1261. 15. Lancaster, W. et al. : Demonstration of two distinc classes of bovine papillomavirus. Virology 89, 1978, s. 371 - 379. 16. Lin, Y. et al. : Cottontail rabbit papillomavirus L1 protein - based vaccines : protection is achieved only with a full - - length, nondena tured product. J. Virol. 67, 1993, s. 4154 - - 4163. 17. Meisels, A. et al. : Condylomatous lesions of the cervix and vagina. I. Cytological patterns. Acta Cytol. 20, 1976, s. 505 - - 509. 18. Münger, K. et al. : The E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J. Virol. 63, 1989, s. 4417 - 4423. 19. Nyklíček, O. et al. : Postižení děložního čípku lidským papillomavirem. Čs. Gynek. 50, 1985, s. 103 - 108. 20. Nyklíček, O. et al. : Současný stav poznatků při postižení děložních čípků lidským papillomavirem. Čs. Gynek. 51, 1986, s. 556 - 561. 21. Nyklíček, O. : Současný pohled na infekci genitální oblasti lidským papillomavirem. Gynekolog 4, 1993, s. 96 - 98. 22. Olson, C. et al. : Cutaneous sarcoma - like lesions of the horse induced by the agent of bovine papilloma. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 77, 1951, s. 281 - 284. 23. Pirisi, L. et al. : Transformation of human fibroblasts and keratinocytes with human papillomavirus type 16 DNA. J. Virol. 61, 1987, s. 1061 - 1066. 24. Rous, P. et al. : Carcinomatous changes in virus - induced papillomas of the skin of the rabbit. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 32, 1934, s. 578 - 580. 25. Scheffner, M. et al. : The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 63, 1990, s. 1129 - 1136. 26. Schwarz, E. et al. : Structure and transcription of human papillomavirus type 18 and 16 sequences in cervical carcinoma cells. Nature 314, 1985, s. 111 - 114. 27. Shope, R. : Infectious papillomatosis of rabbits. J. Exp. Med. 58, 1933, s. 607 - 627. 28. Strauss, M. et al. : "Crystaline" virus - like particles from skin papillomas characterized by intranuclear inclusion bodies. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 72, 1949, s. 46 - 50. 29. Syrjänen, K. : Epidemiologicky of human papillomavirus (HPV) infections and their associations with genital squamous cell cancer. APMIS 97, 1989, s. 957 - 970. 30. Werness, B. et al. : Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science 248, 1990, s. 76 - 79. 31. Yasumoto, S. et al. : Human papillomavirus type 16 DNA induced malignant transformation of NIH 3T3 cells. J. Virol. 57, 1986, s. 572 - 577. 32. zur Hausen, H. et al. : Attemps to detect virus - specific DNA sequences in human tumors. I. Nucleic acid hybridizations with comlementary RNA of human wart virus. Int. J. Cancer 13, 1974 a), s. 650 - 656. 33. zur Hausen, H. et al. : Attemps to detect virus - specific DNA sequences in human tumors. II. Nucleic acid hybridizations with complementary RNA of human herpes group viruses. Int. J. Cancer 13, 1974 b), s. 657 - 664. 34. zur. Hausen, H. :The role of viruses in human tumors. Adv. Cancer Res. 33, 1980, s. 77 - 107. 35. zur. Hausen, H. : Intracellular surveillance of persisting viral infections : human genital cancer resulting from failing cellular control of papillomavirus gene expression. Lancet 2, 1986, s. 489 - 491. 36. zur. Hausen, H. : Papillomavirusess in anogenital cancer : a model to understand the role of viruses in human cancers. Cancer Res. 49, 1989, s. 4677 - 4681. 37. zur. Hausen, H. : Human papillomaviruses in the pathogenesis of anogenital cancer. Virology 184, 1991, s. 9 - 13. 38. zur. Hausen, H. : Disrupted dichotomous intracellular control of human papillomavirus infection in cancer of the cervix. Lancet 343, 1994, s. 955 - 957. 39. zur. Hausen, H. : Roots and perspectives of contemporary papillomavirus research. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 1996, s. 3 - 13

Prof. MUDr. Otakar Nyklíček, DrSc. FIAC

Bartoňova 1489, Náchod